ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3791—2020 鸡心包积液综合征诊断技术 Diagnostic techniques for chicken hydropericardium syndrome 2020-11-12发布 2021-04-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3791—2020 宝前 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心、湖北省农业科学院、山东省农业科学院、青岛易邦生 物工程有限公司。 本标准起草人：刘华雷、王静静、温国元、李玉峰、李阳、赵云玲、王媛媛、王红、于晓慧、黄兵、罗青平、范 根成、王志亮。 I NY/T 3791—2020 引言 鸡心包积液综合征（Hydropericardiumsyndrome，HPS），又称安卡拉病（Angraradisease）或“心包积 液-肝炎综合征”（Hepatitis-hydropericardium syndrome，HHS），主要是由I群禽腺病毒4型（Fowlade- novirusserotype 4,FAdV-4)引起的鸡的一种高度接触性传染病。本病多发于3周龄～6周龄的肉鸡，也 可见于肉种鸡和蛋鸡。本病可垂直传播和水平传播。在发病初期无明显症状，病鸡精神萎靡后24h内死 亡，发病急，致死率极高。发病鸡群多于3周龄开始死亡，4周龄～5周龄达到高峰，高峰持续4d～8d，5 周龄～6周龄死亡减少。病程8d～15d,死亡率达20%～80%。剖检以心包积液为典型特征，肾脏肺脏 肿大、肝脏肿大变色坏死，肝细胞内有嗜碱性包涵体。 禽腺病毒根据其抗原性不同分为1、I和Ⅲ3个群，其中，1群可分为A～E5个种共12种血清型，主 要引起包涵体肝炎（Inclusionbodyhepatitis，IBH）和心包积液综合征（HPS）及肌胃糜烂（GE）等。而心包 积液综合征主要是由1群C种血清4型的禽腺病毒引起的。自20世纪80年代以来，我国就存在1群腺 病毒的流行，以包涵体肝炎为主要临床特征，主要通过垂直传播，流行的病毒以血清8a/b型和血清11型 为主。病毒致病性相对温和，单独感染发病率和死亡率不高，在全国呈普遍流行，与传染性法氏囊病等发 生混合感染时可导致鸡群较高的死亡率。然而，自2012年开始，在江苏、山东、河南等地则出现了以心包 积液和肝脏肿大为主要特征的新型！群腺病毒的流行。这种疫病除了可以垂直传播之外，还出现了可通 过粪口途径进行水平传播的流行特点。监测表明，导致这种疫病发生的病毒属于禽腺病毒1群血清4型。 这种国内新出现的禽腺病毒4型1987年首次发生于巴基斯坦，被命名为“安卡拉病”。该病在墨西哥、俄 罗斯、印度、智利、伊拉克、秘鲁、日本、韩国、巴基斯坦和孟加拉国等国均有发生和流行的报道。 Ⅱ NY/T3791—2020 鸡心包积液综合征诊断技术 1 范围 本标准规定了鸡心包积液综合征的临床诊断、病毒分离、琼脂扩散试验、聚合酶链式反应（PCR）、荧光 定量PCR和病毒中和试验的技术要求 本标准适用于鸡心包积液综合征的诊断 所、检疫、检测、监测和流行病学调查等。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件 仅注 日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文 新版本包据 GB/T6682 GB19489 室 物安通 NY/T541 医 集保 云输技术规范 NY/T1948 善 S 3缩略语 下列缩略 用天本 CPE：致细 ffect) DNA：脱 糖核酸 oxyribonucleica FAdV-4: 病毒 HPS:鸡心 液练 vdrop LMH：鸡用 细胞 non PBS：磷酸盘 PCR：聚合酶 VP Real timePCY ehain SPF：无特定病 SD TCIDso：组织半数 VN：病毒中和试验（Vin 4临床诊断 当鸡出现以下2种或2种以上情形时 可作为初步诊断的代 a) 临床发病急，突然死亡，死亡率快速增加 b) 剖检心包腔中有淡黄色清亮的积液； c) 肝脏肿大、坏死、有出血点或出血斑。 样品采集与处理 5.1样品采集 从病死鸡采集的组织样品应以肝脏为主。活禽采集泄殖腔拭子。 5.2样品处理 5.2.1组织样品处理 将病死禽的肝脏等组织样品10g～20g剪碎研磨后，加入5倍体积含有抗生素（青霉素2000IU mL、链霉素2mg/mL、庆大霉素50ug/mL、制霉菌素1000IU/mL）的等渗磷酸盐缓冲液（PBS,pH NY/T 3791—2020 7.0～7.4），充分研磨，然后反复冻融3次，8000r/min离心10min，取上清液经0.22uL滤膜过滤除菌后 接种SPF鸡胚或LMH细胞系。 5.2.2拭子样品处理 将拭子样品在振荡器上充分混合后，将拭子中的液体挤出，室温（20℃～25℃）静置作用30min， 5.3样品保存 处理后的样品应尽快进行病毒分离与鉴定。如不能立即进行鉴定，应置于一80℃进行保存，在4℃保 存不超过1d。 6病毒分离与鉴定 6.1主要仪器 6.1.1倒置生物显微镜。 6.1.2CO)培养箱。 6.1.3微量移液器。 6.1.44℃离心机。 6.1.5细胞培养瓶和细胞培养板。 6.2主要试剂 6.2.1PBS缓冲液：配方见附录A中的A.1。 6.2.2细胞培养液：含10%血清的DMEM培养基。 6.2.3细胞维持液：含1%血清的DMEM培养基。 6.3试验动物与细胞 6.3.1 SPF 鸡胚。 6.3.2ILMH细胞。 6.4试验程序 6.4.1鸡胚接种分离病毒 6.4.1.1用1mL注射器吸取处理后的上清液按每枚0.1ml,经卵黄囊接种5枚6日龄SPF鸡胚。 6.4.1.2接种后，37℃～38℃继续孵育120h。期间每12h观察鸡胚死亡情况，弃去24h内死亡鸡胚。 6.4.1.3收集接种后24h～120h死亡鸡胚和120h仍存活鸡胚，置于2℃～8℃过夜，分别无菌收集尿 囊液进行病毒鉴定。 6.4.2细胞接种分离病毒 6.4.2.2样品接种：将处理好的样品上清液接种单层LMH细胞，孵育1h后吸弃上清液，用PBS缓冲液 轻轻洗涤2次，吸弃后加人细胞维持液，37℃培养72h。 6.4.2.3观察和记录：70%以上单层细胞出现细胞变大变圆、遮光度增加等典型细胞病变时，将细胞培养 物冻融后，离心去掉细胞碎片，取上清液进行病毒鉴定。 6.4.2.4育传：如接种细胞第1代72h后未出现CPE，收获细胞/病毒液按6.4.2.2所述方法再接种 LMH单层细胞进行育传，如此育传3代。 6.5病毒鉴定 对鸡胚尿囊液和出现CPE的细胞培养液，可选用第7章、第8章、第9章或第10章的规定进行鉴定。 7琼脂扩散试验 本方法可用于待检抗原的鉴定或血清抗体的鉴定。其中，待检抗原可为发病禽肝脏组织研磨处理后 2 NY/T3791—2020 的上清液，也可以是病毒培养物。下述方法以待检抗原的鉴定为例。 7.1主要试剂 7.1.1禽腺病毒4型标准抗原。 7.1.2禽腺病毒4型标准阳性血清。 7.1.30.01mol/LPBS(pH7.4)(详见A.1)。 7.1.41%硫柳汞溶液（详见A.2) 7.1.5待检抗原。 7.2操作程序 7.2.1琼脂板制备：在100mLpH7.4的0.01mol/LPBS中加人1 g琼脂糖和8.0g氯化钠，用微波炉 加热至琼脂糖完全融解、混匀，加人1%硫柳汞溶液 45 一50℃时，取灭菌的直径90mm平皿， 每个平皿中加20ml。待完 全凝固后 冷藏备用（不超过7d)。 7.2.2打孔：在已制备 的琼脂 JR 与外周孔距离为3mm。 将孔中的琼脂用8号4 G 脱离平皿底部。 VI 部食防 7.2.3封底：用酒 精灯 团托的底 7.2.4加样：用 多液器在 现化加满款 东准阳书 周礼加满待检 对照，加液量以 S S 不溢出加样孔为 7.2.5感作：力 完毕月， 静置5m 全将 置 放入湿盒内， 37℃恒温孵育 h 菲记 R 7.3结果判定 7.3.1标准阳 清马 标准 出现一 条清晰的自色沉淀线时 无效，需要重 复试验（见图1 乐准阳 GR 标准阳性血范 示准阳性技 琼脂扩散试验结果判定示意 7.3.2待检抗原与标准阳性血清孔之间出现一条明显清晰的自色沉淀线，并与标准抗原对照孔的沉淀线 吻合，判为阳性（见图1)。 7.3.3待检抗原与标准阳性血清之间不形成完整的沉淀线，但标准抗原对照孔与标准阳性血清孔之间的 沉淀线端部向待检抗原孔的内侧弯曲，判为弱阳性。出现弱阳性反应时，应进行重复检验。若重检仍为弱 阳性反应，判为阳性（见图1)。 7.3.4待检抗原与标准阳性血清孔之间无沉淀线，标准抗原对照孔与标准阳性血清孔之间沉淀线直伸延 到待检抗原孔边缘，无弯曲，判为阴性（见图1）。 8 聚合酶链式反应(PCR） 8.1主要仪器 8.1.1PCR仪。 3 NY/T 3791—2020 8. 1.2 2高速台式冷冻离心机。 8.1.3生物安全柜。 8.1.4微量移液器。 8.1.5电泳仪。 8.1.6电泳槽。 8.1.7紫外凝胶成像仪。 8.2主要试剂 8.2.1DNA裂解液（详见A.3）。DNA制备也可用商品化试剂盒。 8.2.2引物：详见表1。 表11 PCR检测引物 引物名称 引物序列 产物大小 4-1S 5'-TCTCCGTCTGTGCCTAAACT-3' 452 bp 4-1A 5'-GAGGACATCGCTTCACTACC-3 8.