ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3790—2020 塞内卡病毒感染诊断技术 Diagnostic techniques for seneca virus A infection 2020-11-12发布 2021-04-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3790—2020 目 次 前言 范围 规范性引用文件 临床诊断 3.1 易感动物 3. 2 临床症状 3.3 病理变化 3. 4 结果判定 4 实验室诊断样品采集· 4.1 器材· 4.2 样品采集 5 病毒分离 5.1 器材. 5. 2 试剂 5.3 样品处理 5. 4 细胞分离病毒 实时荧光反转录聚合酶链式反应（RT-qPCR) 6.1 引物及探针 6. 2 器材· 6.3 试剂· 6. 4 样本采集与处理 6.5 操作方法 6.6 试验成立条件 6.7 实时定量RT-qPCR结果判定 病毒中和试验(VNT) 7. 1 材料准备 7. 2 仪器及设备 7. 3 血清样本的处理 7. 4 操作步骤 7.5 结果分析 间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA) 8.1 材料准备 8.2 仪器及设备 8.3 血清样本的处理 8. 4 操作方法 8.5 结果分析 9 综合判定 10注意事项… 附录A（规范性附录）溶液配制 附录B（规范性附录） 病毒核酸提取 附录C(规范性附录) 塞内卡病毒VP2蛋白的表达与纯化 12 NY/T3790—2020 前冷 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口 本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所、中国动物卫生与流行病学中心。 本标准起草人：郑海学、田宏、杨帆、石正旺、倪博、朱紫祥、张克山、李丹、罗俊聪、郭建宏、何继军、党 文、靳野、刘华南、茹毅、曹伟军、刘永杰、张志、吴发兴、李晓成、刘湘涛。 II NY/T3790—2020 塞内卡病毒感染诊断技术 1范围 本标准规定了塞内卡病毒感染的临床诊断、病毒分离、实时定量反转录聚合酶链式反应、病毒中和试 验（VNT)和间接酶联免疫吸附试验的技术要求 本标准适用于塞内卡病毒感染的诊断、检疫、检测、监测和流行病学调查等。 规范性引用文件 PUBL 下列文件对于本文件 ，仪注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文 最新版本（包 GB19489实验 室生 GB/T27401 实验 至质益控 动物检疫 3 临床诊断 3.1 易感动物 主要感染猜 阶段的猪 征更 3.2临床症状 3.2.1易感动物用 地子 3.2.2易感动物 3.2.3发病后 泡山 3.2.4新生仔猪 3.3病理变化 C 特异性病理变 3.4结果判定 易感动物出现上 采集有临床症状动 物的水泡皮、水泡液，也 清或组织样品送 验室诊断。 4 实验室诊断样品采集 4.1器材 4.1.1手术剪刀和镊子。 4. 1.2 样品保存管。 4.1.3离心管（2mL、10mL)。 4.1.4防水标签。 4.1.5医用防护服。 4.1.6组织匀浆器。 4.1.7高速组织匀浆机。 4.2样品采集 4.2.1水泡液采集 典型临床发病动物水泡液用灭菌注射器吸入后装人样品保存管，加青霉素1000IU/mL、链霉素500 1 NY/T 3790—2020 IU/mL，加盖封口，冷冻保存。 4.2.2水泡皮采集 用0.01mol/LPBS(pH7.4)清洗水泡皮表面，然后用灭菌手术剪刀剪取水泡皮，以2g～5g为宜。 采集到的水泡皮，装入样品保存管，加50%甘油-PBS保存液，使保存液液面没过样品，加盖封口，冷冻 保存。 4.2.3组织样品采集 若采集不到典型的水泡皮，则采集病灶周围破溃组织2g～5g，装人样品保存管，加50%甘油-PBS保 存液，使保存液液面没过样品，加盖封口，冷冻保存。临床表现健康，但需做塞内卡病毒感染病原学检测的 动物，可在屠宰时采集淋巴结、扁桃体。对肉品进行塞内卡病毒感染病原学检测时，可采集骨骼肌，组织样 品应不少于2g，装入样品保存管中，密封，冷冻保存。 5病毒分离 5.1器材 5.1.1倒置显微镜。 5.1.2冰箱（2℃~8℃、一20℃、一70℃等不同温度）。 5.1.3恒温培养箱。 5.1.44℃离心机。 5.1.5微量移液器（10μL~100μL;100μL~1000μL)。 5.1.625cm细胞培养瓶。 5.2试剂 5.2.10.01mol/LpH7.4PBS,配制见附录A中的A.1。 5.2.2细胞培养液，配制见A.2。 5.2.3细胞维持液，配制见A.3。 5.3样品处理 5.3.1在无菌环境中，将采集的动物机体组织（如鼻、蹄部水泡皮)置于组织匀浆器中充分研磨。加人青 霉素1000IU/mL、链霉素500IU/mL,加0.01mol/LPBS(pH7.4)制成1：5的组织悬液，4℃浸毒过 夜。翌日以3000r/min4℃离心10min，取上清液备用。 5.3.2水泡液不经过研磨处理，以3000r/min4℃离心10min，取上清液备用 5.4细胞分离病毒 5.4.1制备单层细胞 按常规方法将继代细胞系（BHK-21)分装在25cm²细胞培养瓶中，每瓶分装细胞悬液5mL，细胞浓 度为2×105/mL~3×105/mL，37℃静置培养48h。 5.4.2接种细胞 浸毒过夜后的组织悬液或水泡液上清液接种细胞。每份样品接种2瓶～4瓶细胞，另设细胞对照2 瓶～4瓶。接种前，先倒去细胞培养瓶中的营养液，加人1mL已经处理好的病料液，37℃静置30min。 然后再加4mL细胞维持液（pH7.6～7.8)。细胞对照瓶不接种样品，倒去营养液后加5mL细胞维持 液，37℃静置培养。 5.4.3观察和记录 通常在接种1d～2d后可出现CPE，主要呈现细胞圆缩、溶解脱落。对照应细胞单层完好，细胞形态 基本正常或稍有衰老。收获细胞液，置于一70℃保存。 5.4.4盲传 如接种细胞第1代72h后未出现CPE，收获细胞/病毒液按5.4.2所述方法再接种生长48h单层细 胞进行盲传，即1mL第1代细胞/病毒液加4mL细胞维持液，37℃培养。 2 NY/T3790—2020 5.4.5结果判定 5.4.5.1细胞病变结果观察。正常细胞对照均形态良好，接种病毒液的细胞出现细胞圆缩、溶解脱落等， 说明细胞出现CPE现象。 5.4.5.2RT-qPCR鉴定。核酸提取见附录B。RT-qPCR方法见第6章。 5.4.5.3综合5.4.5.1和5.4.5.2结果，当细胞出现典型CPE，并且RT-qPCR出现特异性扩增曲线则 病毒分离成功。 6 实时荧光反转录聚合酶链式反应(RT-qPCR) 6.1引物及探针 6.1.1正向引物：5'-GGCCGCCA ICGCTATCT 6.1.3探针引物：5'-FA CTCTCT-BHQ1-3'。 6.2器材 6.2.1荧光定量PO 6.2.24℃高速离 6.2.3微量移液 6.2.4焦碳酸 水处理的店 RAL 6.2.5PCR扩 6.3试剂 6.3.1总RNA 提 6.3.1.1变性液 mol/ 开硫鼠酸或 gent 6.3.1.2 2 mg 乙酸钠 CENT 6.3.1.3酚氯仿 提液 6.3.1.4异丙醇 桥纱 6.3.1.575%乙配 DEPe水按 3 6.3. 1.6 DEPC水 量加大双蒸馅水ddH 6.3.2 RT-PCR试剂 K 6. 3. 2. 1 10XOne Step APCR爱 6.3.2.2 逆转录酶（AMV） 6.3. 2.3 核糖核酸酶抑制剂(R inhibitory QU/ul 6.3.2.4 AMV-OptimizedTaq:5U 6.3.2.5dNTPMixture:包括dATP、dTTP、dCTP,dGTP，各10mmol/L。 6.3.2.6MgCl2:25mmol/L。 6.4样本采集与处理 6.4.1样品选择 用于病原鉴定的组织样品以临床发病动物（猪)未破裂的蹄部、鼻部等的水泡皮和水泡液为宜。对临 床健康但怀疑带毒的动物可在屠宰过程中采集扁桃体、淋巴结等组织作为检测样品进行病毒核酸检测。 6.4.2发病病料的采集和保存 参见4.2。 6.4.3样品准备 6.4.3.1在无菌环境中，将采集的动物机体组织（如鼻、蹄水泡皮)置于组织匀浆器中充分研磨，其他机体 NY/T3790—2020 组织（如淋巴结、扁桃体等)除去包膜和结缔组织，选取内部实质部分，置于组织匀浆器中充分研磨。加入 青霉素1000IU/mL、链霉素500IU/mL,加0.01mol/LPBS(pH7.4)制成1：5的组织悬液，4℃浸毒 过夜。翌日以3000r/min4℃离心10min，取上清液备用。 6.4.3.2水泡液不经过研磨处理，以3000r/min4℃离心10min，取上清液备用。 6.5操作方法 6.5.1核酸提取 见附录B。 6.5.2实时定量RT-qPCR反应体系 6.5.2.1为每个样品准备RT-qPCR混合物。以为待检的批量样品整批准备扩增预混合体系为宜。 6.5.2.2扩增预混合体系为： 2XOne RT-PCR Buffer lI 12.5μL ExTaqHS(5U/μL) 1 μL PrimeScript RT Enzyme Mix Il 1 μL PCR正向引物（10μmol/L) 1 μL, PCR反向引物ReversePrimer(10μmol/L) 1 μL 探针（5μmol/L) 1 μL 总RNA 2 μL DEPC水 5.5 μL 总体积 25 μL 在合