ICS65.020.01 B 10 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3787—2020 土壤中四环素类、氟喹诺酮类、磺胺类、 大环内酯类和氯霉素类抗生素含量 同步检测方法高效液相色谱法 Simultaneous determination of tetracyclines, fluoroquinolones, sulfonamides macrolides and chloramphenicols in soilby HPLCmethod 2020-11-12发布 2021-04-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 3787—2020 全国农 本标准由农业农村部种植业管理司提出并妇口。 本标准起草单位：中国农业科学院农业资源与农业区划研究所、农业农村部农业耕地质量监测保护中 心、北京农学院、中国农业科学院蜜蜂研究所、中国农业大学、中国标准化研究院。 本标准主要起草人：李兆君、冯瑶、李艳丽、陈守伦、魏朝俊、薛晓峰、徐彦军、赵林萍、杨丽。 NY/T3787—2020 土壤中四环素类、氟喹诺酮类、磺胺类、大环内酯类和氯霉素类 抗生素含量同步检测方法 高效液相色谱法 1范围 本标准规定了土壤中四环素类（土霉素、金霉素）、氟喹诺酮类（环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星）、磺胺 类（磺胺噻唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺三甲嘧啶）、大环内酯类（泰乐菌素）和氯霉素类（氯霉素） 共5类11种抗生素含量的高效液相色谱检测方法 本标准适用于土壤中四环素类（土霉素、金德狮巴诺酮类（环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星）、磺胺 类（磺胺噻唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、黄胺 共5类11种抗生素含量的检测 2规范性引用文件 下列文件对于 是必不可小的凡 是注自期的小用文件 适用于本文件。 凡是不注日期的弓 件其量 新版本（包活所有的修改单）适） 体文件 GB/T 6682 折实验 用水规格和武验方法 GB/T3619 质 王壤采技术指南 A 3原理 R 生果 试样中11 缓冲液 有机混合提取剂依次 幸取柱净化处理 工 后进样，高效液相 泽面积法 CE 4试剂和材料 除另有说明处 6682 的规格。 4.1甲醇：色谱纯 R 4.2 2乙晴：色谱纯 U 4. 3 3丙酮：色谱纯 4.4甲酸：色谱纯。 4.5 乙二胺四乙酸二钠（Na2ED 4. 6 柠檬酸(CH：O·H2O)。 4.7 无水磷酸氢二钠（NazHPO，）。 4. 8 柠檬酸溶液：0.1mol/L。称取21.01g柠檬酸（4.6)用水溶解，定容至1000mL，摇匀。 4. 9 磷酸氢二钠溶液：0.2mol/L。称取28.41g无水磷酸氢二钠（4.7），用水溶解，定容至1000mL， 摇匀。 4.10磷酸氢二钠-柠檬酸（Mcllvaine）缓冲液：将1000mL0.1mol/L柠檬酸溶液（4.8）与625ml 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液（4.9)混合并摇匀。必要时，用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调 节pH=4.0±0.1。 1625mLMcllvaine缓冲液（4.10)中，摇匀。 时，用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调节pH=4.0土0.1。 1 NY/T3787—2020 4.1325%甲醇水溶液：量取25mL甲醇（4.1)与75mL水混合并摇勺。 4.1465%甲醇水溶液：量取65mL甲醇（4.1)与35mL水混合并摇匀。 4.150.1%甲酸水溶液：准确吸取1mL甲酸（4.4)于1000mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度， 摇匀。 4.16乙腈-甲酸溶液（1：4）：量取200mL乙睛（4.2)与800mL甲酸水溶液（4.15)混合并摇匀。 4.17OasisHLB固相萃取柱或相当者：500mg/6mL。使用前，依次通过5mL甲醇（4.1)及10mL水 预处理，保持柱体湿润。 4.18标准物质：土霉素、金霉素、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺噻唑、磺胺间甲氧嘧啶、环丙沙星、诺氟 沙星、恩诺沙星、泰乐菌素、氯霉素的药物名称、英文名称、CAS号、分子式、纯度参见附录A中的表A.1。 4.19标准储备溶液：准确称取按其纯度折算为100%质量的土霉素、金霉素、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶 唑、磺胺噻唑、磺胺间甲氧嘧啶、环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、泰乐菌素、氯霉素各10.0mg，环丙沙星、 诺氟沙星、恩诺沙星分别用0.03mol/L氢氧化钠溶液溶解并定容至10mL，其余标准品用甲醇溶解并定 4.20混合标准工作溶液：根据需要，用甲醇（4.1)将标准储备溶液（4.19)配制为适当浓度的混合标准工 作溶液。混合标准工作溶液应现用现配。 5仪器及设备 5.1高效液相色谱仪：配紫外检测器。 5.2真空冷冻干燥机。 5.3分析天平：感量0.01mg,0.001g。 5.4pH计：测量精度土0.02。 5.5涡旋混合器。 5.6超声波清洗机。 5.7 低温高速离心机：转速不低于8000r/min。 5.8固相萃取装置。 5.9旋转蒸发仪。 6分析步骤 6.1样品采集与制备 土壤样品取样方法应符合GB/T36197中的规定，所有土壤样品用洁净棕色瓶密闭保存，用干冰冷藏 保存并运输至实验室，储存于一20℃。将采集回的样品冷冻干燥，研磨过2mm筛，装入洁净的样品瓶中， 密封，并标明标记，常温避光保存，备用。制样操作过程中应防止样品受到污染后残留物含量发生变化。 6.2提取 称取冻干土样（1.00土0.01）g，置于50mL聚乙烯离心管中，加入10mLNazEDTA-Mcllvaine缓冲 液（4.11），涡旋混匀30s（室温）。于4℃下，超声15min，8000r/min条件下离心10min，吸取上清液至 另一洁净的离心管中，残渣再加入1OmL的Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液，重复以上步骤提取一次。提取 2次后的残渣再用10mL有机混合提取剂（4.12）提取2次，每次提取剂用量5mL，步骤同上。合并4次 上清液，过0.45μm有机相微孔滤膜，将过滤后液体在旋转蒸发仪（70r/min，40℃）上浓缩至3mL~ 5mL，用于净化。 6.3净化 将浓缩后的提取液以1mL/min的流速过固相萃取柱（4.17），提取液完全流出后，用5mL25%甲醇 水溶液（4.13)淋洗，弃去全部流出液，并真空抽干5min，最后用10mL65%甲醇水溶液（4.14)洗脱，收集 洗脱液于旋转蒸发仪上蒸至干燥，吸取1mL乙睛-甲酸溶液（1：4)（4.16)定容，过0.22μm有机相微孔 2 NY/T3787—2020 滤膜过滤，供液相色谱-紫外检测器测定。 6.4仪器参考条件 6.4.1色谱柱：T3色谱柱，150mm×4.6mm，3um或相当者。 6.4.2流动相：A：0.1%甲酸水溶液（4.15),B:乙睛（4.2)梯度洗脱条件见附录B的表B.1。 6.4.3流速：1.0mL/min。 6.4.4检测波长：274nm。 6.4.5柱温：40℃。 6.4.6进样量：10μL。 6.5标准工作曲线绘制 分别移取一系列浓度为0.1mg/L.0.5mg/ ，5.0mg/L.10.0mg/L和50.0mg/L的抗 生素标准工作液。按仪器参 11种抗生素的标准物质高效液相色谱图 6.6试样测定 Q 将试样溶液按 孝茶 行测定，记录色谱峰面积 谱峰的 为峰而积从标准曲线上求 出相应的浓度。样 测物响垃值均应 则应 重新调整浓度后 测定。 S S 注：当测定结果低 仪器测 整称糕 高手仪器测 周，则应稀释后再进样 测定。 L ARCH 6.7平行试验 按以上步 试式划 6.8空白试验 U 除不加试 均按 1 结果计算 按式(1)计算日 GR (1) 式中： X; 样品中被测 标抗生素的质量浓度，单位为毫克每工克（mg kg) Co 空白试验中被测日标抗生素的质浓度单 位为毫克每开（mg/） C; 标准曲线查得日标抗生素的质量浓度，单位为毫克每升（mg V 样品溶液定容总体利 单位为毫升（mL）； m 样品质量（干基），单位为克( 方法检出限与定量限 （LOQ）。检出限与定量限参见附录D中的表D.1。 9回收率与精密度 在添加浓度5mg/kg、10mg/kg和50mg/kg时，回收率分别介于62.7%~90.4%、72.4%~97.1% 和74.1%99.2%，相对标准偏差低于10%。回收率与精密度参见附录E中的表E.1。 10允许差 在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%。 3 NY/T3787—2020 附录 A （资料性附录） 11种抗生素的药物名称、英文名称、CAS号、分子式、纯度 11种抗生素的药物名称、英文名称、CAS号、分子式、纯度见表A.1。 表A.1 111种抗生素的药物名称、英文名称、CAS号、分子式、纯度 药物名称 英文名称 CAS号 分子式 纯度,% 土霉素 Oxytetracycline 2058-46-0 C22 H2s CIN2 Og >96.0 金素 Chlortetracycline 64-73-3 Ca, H2 CIN, Os ≥93.0 诺氟沙星 Norfloxacin 70458-96-7 Cig H2, FN, O ≥97. 2 93107-08-5 环丙沙星 Ciprofloxacin Ci Hig CIFN O3 ≥92.3 86483-48-9 恩诺沙星 Enrofloxacin 93106-60-6 Crg H22 FN, O3 ≥99.5 磺胺噻唑 Sulfathiazole 72-14-0 C, H, N, O,S ≥99.0 磺胺二甲