ICS65.020.01 B 04 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3785—2020 葡萄扇叶病毒的定性检测 实时荧光PCR法 Qualitative detection of grapevine fanleaf virus-Real time fluorescence PCR method 2020-11-12发布 2021-04-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3785—2020 前人品言 全国 本标准由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院果树研究所 食典通 本标准主要起草人：范旭东、董雅凤、张尊平、任装、甜国君。 I NY/T3785—2020 葡萄扇叶病毒的定性检测 实时荧光PCR法 1范围 本标准规定了葡萄植株和离体繁殖材料中葡萄扇叶病毒的实时荧光PCR检测方法。 本标准适用于葡萄植株和离体繁殖材料 中葡萄扇叶病的 定性检测。 2规范性引用文件 凡是不注日期的引用文 GB/T6682分析实验 用水规格和试验 3缩略语 下列缩略语 cDNA:互补 脱 PCR：聚合 式反应 DNA：脱氧 售核酸 M-MLV: 尼 岛反转录酶 dNTPs:4 氧物目 包括dATP、dGTPdTTPdCTP）混斧 DEPC：焦 七酯 RNA：核糖核 D Taq:水生栖热 RNase:核糖 GRI Tris-HCl：盐配 4原理 人 根据葡萄扇叶病毒 物2A 基内的特异性序列， 对用于葡萄扇！ 每PCR检测的特异性 引物。首先利用反转录酶将RNA反转录成DNA再以CPNA 为模板进 时荧光PCR反应，SYBR Green1荧光染料掺人DNA双链发射荧光信号而不掺人链中的染料分 不发射任何荧光信号，从而保 证荧光信号的增加与PCR产物的增加 全同步。通过实时荧光PCR仪检测荧光信号，将其转换成扩增 曲线，并通过扩增曲线的数据来进行结果判定 5仪器与设备 5.1实时荧光PCR检测仪。 5.2超微量紫外核酸蛋白检测仪。 5.3电子天平：感量为0.01g。 5.4高速冷冻离心机：转速在12000r/min以上。 5.5恒温金属浴。 5.6微量移液器：量程分别为0.1μL～2.5μL0.5μL~10L、5μL～20μL、10μ～100μL、20μL~ 200 μL、100 μL~1 000 μL 1 NY/T3785—2020 6试剂与耗材 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T6682中一级水的规格。 6.1M-MLV反转录酶：浓度为200U/μL。 6.2dNTPs：浓度为2.5mmol/L。 6.3DEPC水：取DEPC100μL，加双蒸水至100mL，混勺，室温过夜，121℃高压灭菌15min。 注：由于DEPC具有刺激性和毒性，因此处理时应在通风橱中进行。也可购买商品化的DEPC处理水。 6.410%二烷基肌氨酸钠：称取5.00g二烷基肌氨酸钠，溶于DEPC处理的灭菌双蒸水中，定容至 50mL。 6.5随机引物：含有6个碱基的随机序列。 6.6引物： 3'-引物:5'-AGGAGGAGGCGAAGGAATC-3'。 6.7裂解液：分别称取硫氰酸胍47.20g、醋酸钠1.64g、乙二胺四乙酸0.74g、醋酸钾9.80g、聚乙烯吡 咯烷酮（K30)2.50g，溶于DEPC处理的灭菌双蒸水中，定容至100mL。 6.8去蛋白液：分别称取硫氰酸胍35.40g、Tris-HCI0.34g，溶于DEPC处理的灭菌双蒸水，定容至 50mL，加人无水乙醇50mL。 6.9漂洗液：分别称取氯化钠0.10g、Tris-HCI0.03g，用DEPC处理的灭菌双蒸水定容至20mL,加人 无水乙醇80mL。 6.10反转录混合液：含5X反转录反应缓冲液、dNTPs、RNase抑制剂和M-MLV反转录酶，配制方法见 附录A。 6.11荧光PCR扩增混合液：含有2XSYBRGreenqPCR混合反应液、5'-引物和3'-引物，配制方法见附 录A。 6.12RNA提取吸附柱及套管。 6.13荧光PCR检测专用8联管和盖子。 7 操作步骤与方法 7.1样品制备 叶片样品：取待测葡萄叶片，用灭菌双蒸水冲洗、滤纸擦拭干净 枝条样品：将待检枝条截取5cm~10cm，刮取其韧皮部组织，放入样品袋中。 组培苗样品：取整株小苗或截取部分茎段（带叶），灭菌双蒸水冲洗，去掉琼脂培养基。 注：样品制备过程应避免交叉感染，并戴一次性灭菌手套。 7.2RNA提取 取100mg葡萄试样置研钵中，加入1mL裂解液研磨成匀浆。取1mL匀浆加入预先加人10%十二 离心10min。移上清液600μL于一个新的离心管中，加人300μL的无水乙醇，混勾。将混合物加人吸附 柱中，再将吸附柱放入收集管中，12000r/min离心60s，弃掉废液。加700μL去蛋白液于吸附柱中，室 温放置2min，12000r/min离心60s，弃去废液。加700μL漂洗液于吸附柱中，12000r/min离心60s， 弃去废液；加入500μL漂洗液，重复离心一次，弃去废液。将吸附柱放回空收集管中，12000r/min离心 2min，除去漂洗液。取出吸附柱，放人无RNase离心管中，在吸附柱的中间部位加50μLDEPC处理的 灭菌纯水（事先在65℃水浴中预热），室温放置1min，12000r/min离心1min。离心得到的RNA溶液 立即进行反转录或一80℃冻存，存放时间不宜超过6个月。 7.3反转录 2 NY/T3785—2020 将约1μg的RNA和1μL随机引物加到1.5mL离心管中，用DEPC水补足10μL，72℃金属浴保温 10min后，立即放置在冰浴中。单个测试样本反转录混合液配制见附录A，根据测试样本数量按比例加 入各试剂，混匀，向上述RNA和随机引物的混合液中各加入15L。将含混合均匀的离心管放置于恒温 金属浴中37℃保温10min，42℃保温50min，72℃保温10min。反转录合成的cDNA立即进行实时荧光 PCR反应或一20℃冻存，存放时间不宜超过6个月。 7.4实时荧光PCR扩增 将实时荧光PCR反应所需试剂置冰浴中融化。单个测试样本反应混合液配制参见附录A，根据测试 样品数量按比例加人各试剂，混匀，向每个实时荧光PCR管中加人24.0μL，再加入反转录产物1.0μL， 混勾。将实时荧光PCR反应管放入荧光PCR检测仪内。设置反应程序为：95℃3min；95℃15s， 52℃15s,72℃20s，40个循环。设置PCR仪在每个循环的72℃延伸阶段收集荧光信号。反应结束后， 绘制产物的熔解曲线。 7.5实验对照 阳性对照：已知感染葡萄扇叶病毒的样品RNA反转录的cDNA。 阴性对照：已知未感染葡萄扇叶病毒的样品RNA反转录的cDNA。 空白对照：以灭菌双蒸水代替cDNA。 8结果判定和描述 8.1有效判定原则 对照同时满足下列情况的，则认为结果有效，否则认为无效，应重新进行检测： 空白对照应无Ct值，或Ct值应>35.0，但未出现典型的扩增曲线，且熔解曲线的解链温度峰值与阳 性对照不一致。 阴性对照应无Ct值，或Ct值应>35.0，但未出现典型的扩增曲线，且熔解曲线的解链温度峰值与阳 性对照不一致。 阳性对照Ct值应≤30.0，并出现典型的扩增曲线。 注：典型的扩增曲线及熔解曲线的解链温度参见附录B。 8.2检测结果判定 若检测结果无Ct值，或Ct值>35.0，但无典型的扩增曲线，且熔解曲线的解链温度峰值与阳性对照 不一致，表示样品中不含葡萄扇叶病毒。 若检测结果Ct值≤30.0，出现典型的扩增曲线，且熔解曲线的解链温度与阳性对照一致，表示样本 中含葡萄扇叶病毒。 若检测结果Ct值为30.0～35.0，需重新进行荧光PCR检测，再次检测结果Ct值仍小于35.0，出现 典型的扩增曲线，且熔解曲线解链温度峰值与阳性对照一致，则判定样本中含有葡萄扇叶病毒；否则判定 样品中不含有葡萄扇叶病毒。 8.3结果描述 该样品检出葡萄扇叶病毒。 该样品未检出葡萄扇叶病毒。 3 NY/T3785—2020 附录A （规范性附录） 葡萄扇叶病毒反转录反应及实时荧光PCR反应混合液配制 A.1单个测试样本反转录反应混合液配制方法 见表A.1。 表A. 1 单个测试样本反转录反应混合液配制的组分及使用量 试 25μL反应体系终浓度 5X反转录反应 冲液 g4 1X 2.5m 0. 4 mmol/L 10U/ 抑制剂 2 U/μl, 200U/ MLV皮转 U/μL DEI 理的灰菌 A.2单个测试样本荧光PCR扩增反应混合液配制方 URA 见表A.2。 单个测试样本荧光PCR扩增反应混合液配制的组分及 使用量 剂 使用量，u 反 系终浓度 2XSY BF Greer 物口 bl/L ol/L NY/T3785—2020 附录B （资料性附录） 典型的实时荧光PCR扩增曲线及熔解曲线解链温度 B. 1 典型的实时荧光PCR扩增曲线 见图B.1。 阳性对照 测试样品 阴性对照空白对照 1500 相对荧光强 00S 10 20 30 40 循环数 图B.1 典型的实时荧光PCR扩增曲线 B.2典型的实时荧光PCR溶解曲线解链温度 见图B.2。 测试样品 空白对照阴性对照 阳性对照 300 光值 相对荧 200 100 65 70 75 80 85 90 95 温度，℃ 图B.2 熔解曲线解链温度 5