ICS 67 B 23 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3756—2020 蚕豆品种真实性鉴定 SSR分子标记法 Faba bean[ Vicia faba (L.) Lam.Jvariety genuineness identification- SSR-based methods 2020-11-12发布 2021-04-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3756—2020 目 次 前言 范围 规范性引用文件 术语和定义 缩略语· 5 原理 6 检测方案 仪器设备、试剂和溶液配制 检测程序 8 结果计算与表示 10结果报告· 附录A（资料性附录） 溶液配制 附录B(资料性附录） 12对SSR引物标记四色荧光引物分组方案 附录C(资料性附录) 等位变异扩增片段信息（毛细管电泳） 附录D(资料性附录) 参照样品名单· NY/T3756—2020 萌农 全国 典通 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不应承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部种业管理司提出。 本标准由全国农作物种子标准化技术委员会（SAC/TC37)归口。 本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、中国农业科学院作物科学研究所、甘肃省种子管理局 青海省种子管理站。 本标准主要起草人：晋芳、宗绪晓、赵建宗、杨涛、张力科、张红岩、支巨振、季一山、刘荣、傅友兰、戴铮 包天忠、任雪贞。 II NY/T3756—2020 蚕豆品种真实性鉴定 SSR分子标记法 1范围 本标准规定了利用SSR分子标记法进行蚕豆[Viciafaba（L.）Lam.常规品种真实性检测的术语和 定义，缩略语，原理，检测方案，仪器设备、试剂和溶液配制，检测程序，结果计算与表示和结果报告。 本标准适用于蚕豆品种真实性验证和品种真实性身份鉴定，不适用于实质性派生品种（essentialde- rivedvariety，EDV)的鉴定。 2规范性引用文件 凡是不注日期的引用文件， GB/T3543.1农作物种 检验机程 GB/T 3543.2 农作物种子检验判 GB/T3543.5 农作物种子检验规程 实性和品种纯度鉴 GB/T6682 分析实 验室用水 规格和式验方法 S 3术语和定义 下列术语和定 3. 1 R 品种真实性 供检样品与标准 品种是 3. 2 品种真实性验证 variet verification 与其对应品种名 的标准科 3. 3 品种真实性身份鉴定 品种名称。 3. 4 标准样品standardsample 国家指定机构保存的代表品种特征特性的实 样品或 3.5 SSR指纹数据比对平台SSRfingerprintblastplatform 采用SSR标记的标准化方法对品种标准样品的等位变异进行检测，并运用计算机数据库技术和网络 信息技术所构建的品种分子数据信息的检索比对载体。 3. 6 参照样品referencesample 具有SSR位点上主要等位变异的品种，用于辅助确定试验样品的等位变异，校正仪器设备的系统 误差。 3.7 核心引物组合 coreprimerpanel 最大限度区分某一作物品种的一套最少数量的引物。 NY/T3756—2020 3. 8 扩展引物组合extendedprimerpanel 辅助真实性检测的一套引物。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对（basepair） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammoniumbromide） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate) PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） SSR：简单重复序列（simplesequencerepeat） Taq酶：耐热DNA聚合酶（Taq-DNApolymerase） 5原理 蚕豆不同品种的基因组存在着能够世代稳定遗传的简单重复序列(SSR)的重复次数差异。这种差异 可以通过从有代表性的试验样品中提取DNA，用SSR引物进行扩增和电泳检测出来，因此，可以利用扩 增片段大小不同区分品种。 依据SSR标记检测原理，采用SSR引物，通过与标准样品比较或与SSR指纹数据比对平台比对的方 式，对品种真实性进行验证或身份鉴定。真实性验证依据SSR位点差异数目而判定，品种真实性身份鉴 定依据被检SSR位点无差异原则进行筛查和鉴定。 6检测方案 6.1通则 对于真实性鉴定，引物、检测平台、样品状况不同，其检测结果的准确度、精确度可能有所不同。应依 据“适于检测日的”的原则，统筹考虑检测规模和检测能力，选定适宜的检测平台、样品状况，制订相应的检 测方案。 在严格控制条件下，合成选择的引物，按照确定的检测平台对试验样品按DNA提取、PCR扩增、电 泳、数据分析的程序进行检测。 按规定要求填报检测结果，检测报告应注明检测方案所选择的影响检测结果的关键信息。 DNA提取、PCR扩增和电泳的技术条件要求，在适于检测目的和不影响检测质量的前提下，按照检 测平台的要求，允许对本标准的规定作适当调整。 6.2检测平台 品和标准样品，亦可与标准样品指纹比对；真实性身份鉴定，宜采用毛细管电泳。利用SSR指纹数据比对 平台进行鉴定 6.2.2对于试验样品数量较多的，可将组织研磨仪、DNA自动提取、自动移液工作站、高通量PCR扩增 仪、DNA分析仪进行组合，以提高检测的综合效率。 6.3引物 6.3.1选12对SSR引物作为品种真实性验证和身份鉴定的引物，具体见表1。 2 NY/T3756—2020 表1 核心引物信息 编号 引物名称 连锁群 退火温度，℃ 引物序列（5'-*3') FM01 正向：TCCTCAAACATGCAGGACAG SSR11052 LG5 60 反向：TTGTTCCGAGCAACAGTTTG FM02 正向：CTCTCTAGTGGCCTGGGTGT SSR13106 LG5 60 反向：CGATGGGGTGTTTCTCTCTC 核心引物 正向：ACCACCTTCTGAGGAACAGC FM03 SSR10911 L.G5 55 反向：TTGTGCAAATATGACATTTTATTTAAG 正向：CCGATTTCAGCAACCTGTTT FM04 SSR12080 IG2 60 反向：GTGACCCCATTTGCAGACTC 向：CACCTCCACCCCGTACTCTA FM05 SSR17991 LG5 60 反向：A ACAAGGTGCTTCCACCAG 正向：GAGA AAGCGGCTGCTTAGA FM06 EST181 LG1 PUB 反向：GOTGTCAC CCGAGAATGATGA FM07 EST 反向：ECAC CTCTCO CCATCTAC FM08 TGAGTCCCA ATTGAA CTTGC 正向 EGCC ACAAOCA 扩展引物 FM09 GG TTA CAATCC ACCACA A TCA AGCCAAT TOACCC FM10 STOO TT kCCTCeC G EALATATGGG FM11 SSR136 GACT I'G A GAATTGACC TOACT MTC TTCA 尚：CGTTGCCTGG FM12 TC ACGACGAATT CCACCA R引物由中国农业 注：本表中12x 勿科学研究所冷季食用竞类课题组直主开发 工 6.3.2品种真实 生 证允诊 到可以 判 定不符结果 的差异位点数的， 止检则 点数时 的美异 继续完成扩 展引物的检测。 6.3.3品种真实性 采用表 对SSR物构建试验样品指 SSR 纹数据 居比对平台比较筛 查与试验样品指纹 6.4样品 6.4.1试验样品可以为种胚幼苗、 或器官 嘉要托样的样 数量应 合GB/T3543.2的 规定。 6.4.2 试验样品不少于45个个 战单个 体独守检测 6.5检测条件 真实性鉴定应在有利于检测实施的控制条件下进行，包含但不限于下列条件： a) 检测员熟悉所使用检测技术的知识和技能； b) 所有仪器与使用的技术相匹配，并已经过定期维护、验证和校准； c) 使用适当等级的试剂盒、灭菌处理的耗材； d) 使用校准检测结果评定的适宜参照品种。 7仪器设备、试剂和溶液配制 7.1 仪器设备 7.1.1DNA提取 高速冷冻离心机、水浴锅、紫外分光光度计、酸度计、移液器、组织研磨仪等。 3 NY/T3756—2020 7.1.2PCR扩增 PCR扩增仪、移液器等。 7.1.3电泳 7.1.3.1变性PAGE垂直板电泳 高压电泳仪、垂直板电泳槽及制胶附件、胶片观察灯、水平摇床、数码相机或凝胶成像系统、移液器等。 7.1.3.2毛细管电泳 DNA分析仪等。 7.1.4其他器具 微量移液器、电子天平、高压灭菌锅、电热恒温鼓风干燥箱、加热磁力搅拌器、冰箱等。 7.2试剂 7.2.1DNA提取 液氮、聚乙烯吡咯烷酮K30（Polyvinyl-pyrrolidone，PVP）、十六烷基三甲基溴化铵（CetylTriethyl AmmoniumBromide，CTAB）、氯化钠、乙二胺四乙酸（Ethylenediamine-tetraaceticacid，EDTA）、三羟甲 基氨基甲烷（Trishydroxymethylaminomethane，Tri