ICS 67 B 23 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3755—2020 豌豆品种真实性鉴定 SSR分子标记法 Pea[Pisum sativum(L.) Lam.Jvariety genuineness identification- SSR-based methods 2020-11-12发布 2021-04-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3755—2020 目 次 前言 范围 2 规范性引用文件 术语和定义 缩略语· 5 原理 6 检测方案 仪器设备、试剂和溶液配制 8 检测程序 9 结果计算与表示 10结果报告 附录A（资料性附录） 溶液配制 附录B(资料性附录) 13对SSR引物标记四色荧光引物分组方案 附录C(资料性附录) 等位变异扩增片段信息（毛细管电泳） 附录D（资料性附录） 参照样品名单 NY/T3755—2020 前 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。】 请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。 本文件的发布机构承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部种业管理司提出。 本标准由全国农作物种子标准化技术委员会（SAC/TC37)归口。 本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、中国农业科学院作物科学研究所、江苏省种子管理站、 云南省种子管理站、四川省种子站。 本标准主要起草人：周泽宇、宗绪晓、张力科、杨涛、刘丰泽、金石桥、张红岩、赵建宗、季一山、刘荣、任 雪贞、杨华、黄正仙、李昱。 ⅡI NY/T3755—2020 豌豆品种真实性鉴定 SSR分子标记法 1范围 本标准规定了利用SSR分子标记法进行豌豆[Pisumsativum（L.)Lam.］常规品种真实性检测的术 语和定义，缩略语，原理，检测方案，仪器设备、试剂和溶液配制，检测程序，结果计算与表示和结果报告。 本标准适用于豌豆品种真实性验证和品种真实性身份鉴定，不适用于实质性派生品种（essentialde rivedvariety，EDV)的鉴定。 2规范性引用文件 PUBL 凡是不注日期的引用文件，其最新版本包括所有的修 GB/T3543.1 农作物利 子检验规程 GB/T3543.2 表作物种子检验规程 干样 GB/T 3543.5 农作物种子检验规程 实性和品种纯度！ GB/T6682 分析 实验窗用水规格和试验 3 术语和定义 下列术语和定 3. 1 品种真实性 val enuinenes 供检样品与标准 CEI 3. 2 5 品种真实性验证 varioty verifieation 与其对应品种名称的标准样 实供检样品的盒种名称与标注是 相付 品 检测证买 3.3 品种真实性身份鉴定 经分子技术检测并通过相应品种指 旨纹数据比对平台筛香比较确定供检样品的 真实品种名称。 3. 4 标准样品 standardsample 国家指定机构保存的代表品种特征特性的实物样品或DNA样品 3.5 SSR指纹数据比对平台 SSR fingerprint blast platform 采用SSR标记的标准化方法对品种标准样品的等位变异进行检测，并运用计算机数据库技术和网络 信息技术所构建的品种分子数据信息的检索比对载体。 3. 6 参照样品 referencesample 具有SSR位点上主要等位变异的品种，用于辅助确定试验样品的等位变异，校正仪器设备的系统 误差。 3. 7 核心引物组合 coreprimerpanel 最大限度区分某一作物品种的一套最少数量的引物。 1 NY/T3755—2020 3.8 扩展引物组合extendedprimerpanel 辅助真实性检测的一套引物。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对（basepair） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammoniumbromide） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid） dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate) PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） SSR：简单重复序列（simplesequencerepeat） Taq酶：耐热DNA聚合酶（Taq-DNApolymerase） 5原理 豌豆不同品种的基因组存在着能够世代稳定遗传的简单重复序列（SSR)的重复次数差异。这种差异 可以通过从有代表性的试验样品中提取DNA，用SSR引物进行扩增和电泳检测出来，因此，可以利用扩 增片段大小不同区分品种。 依据SSR标记检测原理，采用SSR引物，通过与标准样品比较或与SSR指纹数据比对平台比对的方 式，对品种真实性进行验证或身份鉴定。真实性验证依据SSR位点差异数目而判定，品种真实性身份鉴 定依据被检SSR位点无差异原则进行筛查和鉴定。 6检测方案 6.1通则 对于真实性鉴定，引物、检测平台、样品状况不同，其检测结果的准确度、精确度可能有所不同。应依 测方案。 泳、数据分析的程序进行检测。 按规定要求填报检测结果，检测报告应注明检测方案所选择的影响检测结果的关键信息 DNA提取、PCR扩增和电泳的技术条件要求，在适于检测目的和不影响检测质量的前提下，按照检 测平台的要求，允许对本标准的规定作适当调整。 6.2检测平台 品和标准样品，亦可与标准样品指纹比对；真实性身份鉴定，宜采用毛细管电泳。利用SSR指纹数据比对 平台进行鉴定。 6.2.2对于试验样品数量较多的，可将组织研磨仪、DNA自动提取、自动移液工作站、高通量PCR扩增 仪、DNA分析仪进行组合，以提高检测的综合效率。 6.3引物 6.3.1选13对SSR引物作为品种真实性验证和身份鉴定的引物，具体见表1。 2 NY/T3755—2020 表1 引物信息 编号 引物名称 连锁群 退火温度，℃ 引物序列（5'-→3'） 正向：GCACATGAAAAATGCCAAAG PM01 P292 LG8 54 反向：CTGTTGCTGTTGGTGGTGAG 正向：GGCAAGCATAAAAGGGACAC PM02 P282 LG1 54 反向：TTCATCCAAGAACCCTCGAC 正向：TCCACCATCTAATCCCCTCTT 核心引物 PM03 SSR21405 LG1 54 反向：AGCTGATTATTGGGCACCTG 正向：GAAGGACCAAATCAATTCTCTAAA PM04 SSR24036 LG2 54 反向：ACCGACGTCAACGACTGATA 正向：ACACGGGATCGAGCTTTAGA PM05 SSR21491 反向：TCCTT CCTCTAACTTCTTCCTTCT 正向：TGATTCTACTTCATTTCACAAACACA PM06 SSR2139 B 成CGTCOIGCACO TAGCTTCTT 正间：GCLNAAC GGCT TAAAACTTC PM07 ES T617 TCGCAOTTG GAAA AGAAGAA AGCCTOGA AACAA PM08 P29 反间 TACC HETNGGGCTGACAGIGT AGG TTTT PM09 CATG S OGAACGACA AACCGA ACC 扩展引物 SR2275 C PM10 RMGICACCTTA ACT 间TTCIGGAAC vosals AAA PM11 PPTOCCTCAAT 正向EAGAAANIGGCC TT PM12 反向TGCATTGCATT GGD HTC $sR258 尚AAGGGGCACAGAGITG PM13 向：TCGCCTT TCTTC 注：本表中13对 豆类课题组自主开 0 M 6.3.2品种真实性验 引物组合进行检 检则到可 定不符结果 的差异位点数的，可终止格 门核心 位点数时， 则继续完成扩 展引物的检测。 T 6.3.3品种真实性鉴定采月 SSR-指纹数据比对平台比较筛 查与试验样品指纹一致的品种 6.4样品 6. 4. 1 试验样品可以为种胚、幼苗、叶片等组织或器官。需要扦样的样品数量应符合GB/T3543.2的 要求。 6. 4.2 试验样品不少于30个个体，可采用混合样或单个个 个体独立检测。 6.5检测条件 真实性鉴定应在有利于检测实施的控制条件下进行，包含但不限于下列条件： a) 检测员熟悉所使用检测技术的知识和技能； b) 所有仪器与使用的技术相匹配，并已经过定期维护、验证和校准； c) 使用适当等级的试剂盒、灭菌处理的耗材； d) 使用校准检测结果评定的适宜参照品种。 7 仪器设备、试剂和溶液配制 7. 1 仪器设备 3 NY/T3755—2020 7.1.1DNA提取 高速冷冻离心机、水浴锅、紫外分光光度计、酸度计、移液器、组织研磨仪等。 7.1.2PCR扩增 PCR扩增仪、移液器等。 7.1.3电泳 7.1.3.1变性PAGE垂直板电泳 高压电泳仪、垂直板电泳槽及制胶附件、胶片观察灯、水平摇床、数码相机或凝胶成像系统、移液器等。 7.1.3.2毛细管电泳 DNA分析仪等。 7.1.4其他器具 微量移液器、电子天平、高压灭菌锅、电热恒温鼓风干燥箱、加热磁力搅拌器、冰箱等。 7.2试剂 7.2.1DNA提取 液氮、聚乙烯吡咯烷酮K30（Polyvinyl-pyrrolidone，PVP）、十六烷基三甲基溴化铵（CetylTriethyl AmmoniumBromide，CTAB）、氯化钠、乙二胺四乙酸（Ethylen