ICS 65.020 B 34 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3754—2020 甘蔗品种真实性鉴定 SSR分子标记法 Sugarcane (Saccharum spp. hybrid) variety genuineness identification- SSR-basedmethods 2020-11-12发布 2021-04-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3754—2020 目 次 前言 1 范围· 规范性引用文件 2 3 术语和定义 4 缩略语· 5 原理. 6 检测方案 7 仪器设备、试剂和溶液配制 8 检测程序 9 结果计算与表示 10结果报告 附录A（资料性附录） 溶液配制 附录B(资料性附录） 等位变异扩增片段信息 NY/T3754—2020 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部种业管理司提出。 本标准由全国农作物种子标准化技术委员会（SAC/TC37）归口。 本标准起草单位：福建农林大学国家甘燕工程技术研究中心、全国农业技术推广服务中心、广州甘蔗 糖业研究所、广西农科院甘蔗研究所、云南农科院甘燕研究所。 本标准主要起草人：王锦达、陈如凯、周泽宇、高三基、金石桥、赵建宗、潘永保、邓祖湖、赵新旺、尚怀 国、齐永文、杨荣仲、吴才文、张力科、晋芳、刘丰泽。 II NY/T3754—2020 甘蔗品种真实性鉴定 SSR分子标记法 1范围 本标准规定了甘蔗（SaccharumSpp.hybrid)常规品种真实性SSR分子标记检测的术语和定义，缩略 语，原理，检测方案，仪器设备、试剂和溶液配制，检测程序，结果计算与表示和结果报告。 本标准适用于甘蔗常规品种真实性验证和身份鉴定，不适用于实质性派生品种（EDV)和转基因品种 的鉴定。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 GB/T3543.1农作物种子 子检验机程 GB/T3543.5 农作物种子检验规利 性和品种纯度 GB/T6682 分析实验室用水 规格和试 3术语和定义 S 下列术语和定义适 重用于本 3. 1 A 品种真实性验证 ariet verification 与其对应品种名称 称的标准样品比较，检测证实供检样品品种名称与标注是否 种样品相符。 工 3. 2 品种真实性身份鉴定 Variety genuineness testing 经SSR分子标记检测升通过店年定品种SSR指纹数据比 香比较 品的真实品 种名称。 ENTER 3. 3 R 标准样品standard sample 国家指定机构保存的代 3. 4 参照样品 reference variety 具有所用SSR位点上不同等位变异的品种用于校准供检样品SSR 位变异已定义扩增产物片段 大小的样品。 3.5 组合引物 panelofprimers 具有相同荧光颜色而扩增片段大小不同、能够组合在一起进行电泳的一组荧光标记引物。 3.6 核心引物 coreprimerpanel 最大限度区分甘蔗品种的一套最少数量的引物。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对（basepair) 1 NY/T3754—2020 CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammoniumbromide) SDS：十二烷基苯磺酸钠（sodiumdodecylsulfate) DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dNTPs：脱氧核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphates） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） SSR：简单序列重复（simplesequencerepeat） Taq酶：耐热DNA聚合酶（Taq-DNApolymerase） PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis） 5原理 甘蔗的不同品种，其基因组存在着能够世代稳定遗传的简单重复序列。这种重复次数的差异可以通 过从抽取有代表性的送验样品中提取DNA，用SSR引物进行扩增和电泳，从而利用扩增片段大小不同而 加以区分。 依据SSR标记检测原理，采用固定数目的SSR引物，通过与标准品种样品比较或与SSR指纹数据库 比对平台比对的方式，对供检样品进行品种真实性验证或身份鉴定。品种真实性验证依据SSR位点差异 数目判定，品种真实性身份鉴定依据被检SSR位点无差异原则进行筛选、鉴定。 6检测方案 6.1总则 品种真实性检测过程中，应根据“适于检测目的”的原则，统筹考虑多方面因素，选择适宜的引物、检测 平台、样品状况、样品规模，制订适宜的检测方案。 6.2检测平台 6.2.1电泳是检测的关键环节。进行品种真实性验证或鉴定可选择采用垂直板变性聚丙烯酰胺凝胶电 泳（PAGE）、荧光毛细管电泳；对于真实性身份鉴定，推荐采用毛细管电泳。 6.2.2对于供检样品数量较多的，可将组织研磨仪、DNA自动提取、自动移液工作站、高通量PCR扩增 仪、多引物组合的毛细管电泳进行组合，以提高检测的综合效率。 6.2.3DNA提取、PCR扩增和电泳的技术条件要求，在适于检测目的和不影响质量的前提下，按照检测 平台的要求允许对本标准的规定作适宜的局部改进。 6.3引物 6.3.1选21对SSR引物作为甘蔗品种真实性验证和身份鉴定的检测引物（见表1)。 表1品种真实性鉴定引物信息 标号 核心引物名称 引物序列（5'→3'） 正向：GCCAAAGCAAGGGTCACTAGA P1 SMC7CUQ 反向：AGCTCTATCAGTTGAAACCGA 正向：AGGGAAAAGGTAGCCTTGG P2 SMC1604SA 反向：TTCCAACAGACTTGGGTGG 正向：CCATTCGACGAAAGCGTCCT P3 SMC22DUQ 反向：CAAGCGTTGTGCTGCCGAGT 正向：ATTCGGCTCGACCTCGGGAT P4 SMC18SA 反向：AGTCGAAAGGTAGCGTGGTGTTAC 正向：ACTAAAATGGCAAGGGTGGT P5 SMC851MS 反向：CGTGAGCCCACATATCATGC P6 正向：AGGTGATTTAGCAGCATA mSSCIR66 反向：CACAAATAAACCCAATGA 2 NY/T3754—2020 表1(续) 标号 核心引物名称 引物序列(5'-→3'") 正向：GCCATGCCCATGCTAAAGAT P7 SMC1751CL 反向：ACGTTGGTCCCGGAACCG 正向：ATTCTAGTGCCAATCCATCTCA P8 SMC336BS 反向：CATGCCAACTTCCAAACAGAC 正向：TTCATCTCTAGCCTACCCCAA P9 SMC119CG 反向：AGCAGCCATTTACCCAGGA 正向：GAAATTGCCTCCCAGGATTA P10 SMC486CG 反向：CCAACTTGAGAATTGAGATTCG 正E向.GCGATGGTTCCTATGCAACTT P11 SMC569CS 反向：TTCGTGGCTGAGATTCACACTA 正向：GCACACCACTCGAATAACGGAT P12 SMC597CS 反向：AGTATATCGTCCCTGGCATTCA P13 mSSCIR3 TCCACAASEATG 正向工TC TAGTGCCAATCCATOCAC P14 间：ATTCAACGAT CACGAG P15 ACCTAGCAATATACAAG? G E向：GCOTTCTCCAAACCAATA P16 m REGTTGTTTATGAATGGIGAG S SEARCH HEHCGCAACGACATATACACT TCCO P17 MTCGACATCACGGAGCAATCAGT EEHCATGCCAACTTCCAATACAGACE P18 反AGTGC AATCCATCICAGAGA SM YGGGTT P19 TCAGTAGCACAGTCAGACGCT 正间CCGCAAGCCACACTGAGA P20 mss AAACAACG SMC J.CAATTCTGACCGTGCAAAGAT P21 反间.CGATGACOTIGATTGCG GAAC 注：本文件所用的 于Suga ech的 lecularGenoty ping of Comme mes 6.3.2品种真实性验证 彩用厂 采用核心引物组合（PP7进们 若检测到可以判 定不符结果的差异位点数的 .可终止检测 若采用核心引物美到可以判是不符结果的差异位点数时，则 继续完成其余引物的检测。 6.3.3品种真实性身份鉴定是在已具备审定品种SSR指纹数据比对平台的前提下，通过构建供检样品 的指纹，利用SSR指纹数据库比对平台能够筛查确定至具体品种。检测时可直接采用表1的21对SSR 引物进行检测，直至与SSR指纹数据比对平台比较后能确定到具体品种为止。经比较后，仍与已知品种 没有位点差异而无法得出结论的，允许采用其他能够区分的方法进行检测。 6.4样品 送验样品可以是叶片或蔗茎，不少于30个个体，从中选取不少于5个有代表性的个体作为试验样品， 可采用混合样或单个个体独立检测的方式。试验样品为叶片时，每个个体叶片不少于1g；试验样品为蔗 茎时，每个个体蔗茎不少于2节。 7 仪器设备、试剂和溶液配制 7.1仪器设备 7.1.1DNA提取 3 NY/