ICS 65.020.01 B 23 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T3753—2020 甘薯品种真实性鉴定 SSR分子标记法 Sweetpotato [Ipomoea batatas (L.) Lam.Jvariety genuineness identificationSSR-basedmethods 2020-11-12发布 2021-04-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3753—2020 目 次 前言 范围 2 规范性引用文件 3 术语和定义 4 缩略语. 5 原理 6 检测方案 7 仪器设备、试剂和溶液配制 8 检测程序 9 结果计算与表示 10结果报告 附录A（资料性附录） 溶液配制 附录B资料性附录） 等位变异扩增片段信息（毛细管电泳） NY/T3753—2020 标 前 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不 应承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部种业管理司提出 本标准由全国农作物种子标准化技术委员会（SAC/TC37)归口。 本标准起草单位：中国农业大学、全国农业技术推广服务中心、江苏徐淮地区徐州农业科学研究所。 本标准主要起草人：刘庆昌、周泽宇、马代夫、金石桥、赵宁、支巨振、翟红、后猛、何绍贞、赵建宗、傅友 兰、张力科、晋芳、刘丰泽。 II NY/T3753—2020 甘薯品种真实性鉴定 SSR分子标记法 1范围 本标准规定了利用SSR分子标记法进行甘薯[Ipomoeabatatas（L.)Lam.常规品种真实性检测的术 语和定义，缩略语，原理，检测方案，仪器设备、试剂和溶液配制，检测程序结果计算与表示和结果报告。 本标准适用于甘薯品种真实性验证和品种真实性身份鉴定 ，不适用于实质性派生品种（essentialde rivedvariety，EDV)和转基因品种的鉴 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的 应用 注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件 ，其最 有的修 GB/T3543.1 GB/T3543.5 物种文检 验规程 实性和品种纯度鉴 GB/T6682 验室用力 规格和试 S 3术语和定义 下列术语和定 3. 1 品种真实性验证 varjety verification 与其对应品种名 称的标准 3.2 品种真实性身份鉴定 variety identification 经SSR分子标记检 纹数据比对平市 帝查比较 品种名称。 3.3 标准样品 国家指定机构保存的 DNA样品 3. 4 SSR指纹数据比对平台 SSR fingerprint blast platform 采用SSR标记的标准化方法对品种标准样品的等位变异进行检测，并 用计算机数据库技术和网络 信息技术所构建的品种分子数据信息的检索比对载体 3.5 参照样品 referencesample 具有所用SSR位点上不同等位变异的品种，用于辅助确定试验样品的等位变异，校正仪器设备的系 统误差。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对（basepair) CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammoniumbromide) DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) 1 NY/T3753—2020 dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate) PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） SSR：简单重复序列（simplesequencerepeat） Taq酶：耐热DNA聚合酶（Taq-DNApolymerase） 5原理 甘薯的不同品种，其基因组存在着能够世代稳定遗传的简单重复序列（SSR)的重复次数差异。这种 差异可以通过从抽取有代表性的试验样品中提取DNA，用SSR引物进行扩增和电泳，从而利用扩增片段 大小不同而加以区分品种。 依据SSR标记检测原理，采用固定数目的SSR引物，通过与标准样品比较或与SSR指纹数据比对平 台比对的方式，对品种真实性进行验证或身份鉴定。真实性验证依据SSR位点差异数目而判定，品种真 实性身份鉴定依据被检SSR位点无差异原则进行筛查、鉴定。 6检测方案 6.1总则 对于真实性鉴定，引物、检测平台、样品状况不同，其检测结果的准确度、精确度可能有所不同。应依据 “适于检测日的”的原则，统筹考虑检测规模和检测能力，选定适宜的检测平台、样品状况，制订相应的检测方案。 泳、数据分析的程序进行检测。 按规定要求填报检测结果，检测报告应注明检测方案所选择的影响检测结果的关键信息。 6.2检测平台 6.2.1对于甘薯品种真实性验证，可选择采用变性PAGE垂直板电泳或者毛细管电泳；对于真实性身份 鉴定，宜采用毛细管电泳。如需要利用SSR指纹数据比对平台，则需要利用参照品种确定试验样品的指 纹后再进行真实性身份鉴定；或在同一电泳板上比较试验样品和标准样品，进行真实性验证。 6.2.2DNA提取、PCR扩增和电泳的技术条件要求，在适于检测目的和不影响检测质量的前提下，按照 检测平台的要求允许对本标准的规定作适当调整。 6.3引物 选7对SSR引物作为品种真实性验证和身份鉴定的引物，具体见表1。 表1引物信息 编号 引物名称 退火温度，℃ 引物序列（5°-→3'） P1 正向：CTCGCTCACGATTGATGATG SPGS1 59. 0 反向：CGGAGTGGTAGGGCTAAACC P2 正向：AGACTGGACTCCCAGAAGCA SPGS2 56.8 反向：CAAGCAGTCAGAAGTCGACAA P3 SPGS3 57.8 正向：CCGATCATTCCCAAACTCAT 反向：AGCAGGGGAGACGTAAGGAT P4 SPGS4 正向：ATCAGAGCCTGGCAAAGAAA 57.5 反向：GGGGAACTTCAGCTAAGCAA P5 正向：AATGCCAACCAAAGCCATAG SPES1 57.9 反向：CGATGACAAAGCAGCTGAAG P6 SPES2 正向：TCGGAACGGAGATAGATTGG 59.0 反向：AAGCAAGAAAAAGAAGTGAAGGAA 正向：ATGACATCCCAAGGAGCATC P7 SPES3 57. 4 反向：GAGGTTGAGGGCGTATCTGA 注：本文件的7对SSR引物由中国农业大学通过甘薯基因组测序和转录组测序获得。 2 NY/T3753—2020 6.4样品 验样品，可采用混合样或单个个体独立检测的方式。 6.5检测条件 真实性鉴定应在有利于检测实施的控制条件下进行，包含但不限于下列条件： a） 检测员熟悉所使用检测技术的知识和技能； 所有仪器与使用的技术相匹配，并已经过定期维护、验证和校准； c) 使用适当等级的试剂盒、灭菌处理的耗材； (P 使用校准检测结果评定的适宜参照品种。 7仪器设备、试剂和溶液配制 7.1仪器设备 7.1.1DNA提取 RD 高速冷冻离心机、水浴锅、紫外分光光度计 酸度计 V 7.1.2PCR扩增 Q PCR扩增仪、移液器等 RES! 7.1.3电泳 7.1.3.1变性PAGE垂直板电池 高压电泳仪、垂 反电泳机 及制胶附件胶片观察灯 数码相机 7.1.3.2毛细管电泳 RA DNA分析仪 7.1.4其他器具 微量移液器、电 执磁力揽器 CE 7.2试剂 7.2.1DNA提取 D 液氮、聚乙烯吡咯 vrrolfdone: triethylam d.ED monium bromide, thylenediamine raa 三羟甲基氨 基甲烷（trishydroxym 疏基醇-mercaptoethano 异戊醇、异丙醇、 乙醇、盐酸、氢氧化钠。 7.2.2PCR扩增 模板DNA、引物、dNTP. 7.2.3电泳 7.2.3.1变性PAGE垂直板电泳 丙烯酰胺（acrylamide）、N，N-亚甲基双丙烯酰胺（methylene-bis-acrylamide）、尿素、去离子甲酰胺 （formamide）、乙二胺四乙酸（EDTA）、溴酚蓝（bromophenolblue）、二甲苯青、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、 硼酸、乙醇（95%）、亲和硅烷（bindingsilane）、剥离硅烷（repelsilane）、过硫酸铵、四甲基乙二胺（tetram ethylethylenediamine，TEMED）、蒸馏水、无水乙醇、冰醋酸、去离子水、硝酸银、氢氧化钠、乙二胺四乙酸 二钠（EDTA-Na2·2HzO)、甲醛、DNAMarker。 7.2.3.2毛细管电泳 与使用的DNA分析仪型号相匹配的分离胶、分子量内标、去离子甲酰胺、电泳缓冲液等。 7.3溶液配制 DNA提取、PCR扩增、电泳、银染的溶液参照附录A的规定进行配制，所用试剂均为分析纯。 试剂配制所用水应符合GB/T6682规定的一级水的要求，其中银染溶液的配制可以使用符合三级要 3 NY/T3753—2020 求的水。 8检测程序 8.1引物合成 选用变性PAGE垂直板电泳，只需合成普通引物。选用毛细管电泳，需合成标记荧光染料的引物。 8.2DNA提取 8.2.1总则 DNA提取方法应保证提取的DNA数量与质量符合PCR扩增的要求，DNA无降解，溶液的紫外光 吸光度OD260/OD280宜介于1.7～2.0。DNA提取可选8.2.2或