ICS 65.020.01 B 30 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T3752—2020 向日葵品种真实性鉴定 SSR分子标记法 Sunflower(Helianthus annuus L.) variety genuineness identificationSSR-basedmethods 2020-11-12 发布 2021-04-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3752—2020 目 次 前言 范围 2 规范性引用文件 3 术语和定义 缩略语 5 原理· 6 检测方案 仪器设备、试剂和溶液配制…. 8 检测程序 9 鉴定意见 10 结果报告： 附录A（资料性附录） 溶液配制 10 附录B(资料性附录) 34对SSR引物标记五色荧光的引物分组方案 12 附录C(资料性附录) 等位变异扩增片段信息 附录D(资料性附录) 参照样品及其等位变异信息 X NY/T3752—2020 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承独识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部种业管理司提出。 本标准由全国农作物种子标准化技术委员会（SAC/TC37)归口。 本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、吉林省白城市农业科学院、赤峰市农牧科学研究院、黑 龙江省农业科学院、内蒙古自治区农牧业科学院、新疆农垦科学院。 本标准主要起草人：张曼、支巨振、牛庆杰、赵建宗、晋芳、刘丰泽、孙墨可、李慧英、任雪贞、田娟、董玉 迪、张雷、于学鹏、王祉诺、谭丽萍、黄绪堂、于海峰、刘胜利。 IⅡI NY/T3752—2020 向日葵品种真实性鉴定 SSR分子标记法 1范围 本标准规定了利用简单重复序列（Simplesequencerepeat，SSR)分子标记法进行向日葵（Helianthus annuusL.）品种真实性检测的术语和定义，缩略话 小方案，仪器设备、试剂和溶液配制，检测程 序，鉴定意见和结果报告。 本标准适用于向日葵品种真实性验证和品种真 身份鉴定：不适用于实质性派生品种（Essential derivedvarieties，EDV)的鉴 P 2规范性引用文件 凡是不注日期的引用 文件 其最辩版 包 所有的修改单）适用于 GB/T 3543.1 农作物种子 验规程 GB/T 3543.2 作物秒子 检验规程 GB/T3543.5 作物种 手检验规程 真实性和品种纯度鉴 折实验车 GB/T6682 用水规格和试验方法 R 3术语和定义 下列术语和定义 适用于 文件 3. 1 品种真实性验证 Variet yverification 与其对应品种名称的标准样品比 ，检测证实供检样品的品种名称 3. 2 品种真实性身份鉴 #检样品的真实品种 名称。 3. 3 标准样品 standardsample 国家指定机构保存的代表品种特征特性的实物样品或DNA样品 3. 4 SSR指纹数据比对平台SSRfingerprintblastplatform 采用SSR标记的标准化方法对品种标准样品的等位变异进行检测，并运用计算机数据库技术和网络 信息技术所构建的品种分子数据信息的检索比对载体 3.5 参照样品 referencesample 具有SSR位点上主要等位变异的品种，用于辅助确定试验样品的等位变异，校正仪器设备的系统 误差。 3. 6 引物组合primerpanel 用来最大能力区分向日葵品种的所有引物的集合。 NY/T3752—2020 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对（basepair) CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammoniumbromide） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphates） PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） SDS：十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate) SSR：简单重复序列（simplesequencerepeat） EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid） TBE：三羟甲基氨基甲烷-硼酸盐-乙二胺四乙酸二钠（Tris-Borate-EDTA） Tris：三羟甲基氨基甲烷［tris（hydroxymethyl）aminomethane Taq酶：耐热DNA聚合酶（Taq-DNApolymerase） 5原理 向日葵不同品种的基因组存在着能够世代稳定遗传的简单重复序列（SSR）的重复次数差异。这种差 异可以通过从试验样品中提取DNA，用SSR引物进行扩增和电泳，从而利用扩增片段大小不同而区分 品种。 依据SSR标记检测原理，采用SSR引物，通过与标准样品比较或与SSR指纹数据比对平台比对的方 式，对品种真实性进行验证或身份鉴定。真实性验证依据SSR位点差异数目而判定，品种真实性身份鉴 定依据被检SSR位点无差异原则进行筛查、鉴定。 6检测方案 6.1总则 对于真实性鉴定，引物、检测平台、样品状况不同，其检测结果的准确度、精确度可能有所不同。应依 据“适于检测目的”的原则，统筹考虑检测规模和检测能力，择定适宜的引物、检测平台、样品状况，制订相 应的检测方案。 泳、数据分析的程序进行检测。 按规定要求填报检测结果，检测报告应注明检测方案所选择的影响检测结果的关键信息。 DNA提取、PCR扩增和电泳的技术条件要求，在适于检测日的和不影响检测质量的前提下，按照检 测平台的要求允许对本标准的规定作出适宜的调整。 6.2检测平台 6.2.1对于向日葵品种真实性验证或身份鉴定，可选择采用变性PAGE垂直板电泳或毛细管电泳，如需 要利用SSR指纹数据比对平台，则需要利用参照样品确定供检样品的指纹后，再进行真实性身份鉴定。 6.2.2对于样品数量较大的，可将组织研磨仪、DNA自动提取、自动移液工作站、高通量PCR扩增仪、毛 细管电泳进行组合，以提高检测的综合效率。 6.3引物 6.3.1避选了34对SSR引物作为品种真实性验证和身份鉴定的引物，具体见表1,引物编号为SFPO1~ SFP34，并据此构建了向日葵登记品种的SSR指纹数据比对平台。 2 NY/T3752—2020 表1 引物信息 编号 引物名称 连锁群 退火温度，℃ 引物序列（5'-3") F:CCGCTAAGTATAAACCGCCTATT SFP01 ORS959 LG1 55 R:CGTCCTCTTCGCATCAATCTTAT F:CACCAGCATAGCCATTCAAA SFP02 ORS342 LG2 55 R: TGTTCATCAGGTTTGTCTCCA SFP03 F:CCCTTTCACTTCCTATTTTCTATTCA ORS1036 LG3 55 R:CTAAGAGGGGTCGGTATGATTTC F:GGGTTGGTGGTTAATTCGTC SFP04 ORS337 LG4 R:TTGGTTCATTCATCCTTGGTC F:CACTCAACCATTGTTCTCCCAC SFP05 ORS240 R:GGTGATGATGGAGGAGCAACTG SFP06 ATTTTGG ORS57 R:CAySXTGG CTAAAAGGTTC SFP07 OTC GATTCA ORS16 GGG TA F:A6 GCATTTCTACO TC SFP08 ORS 55 R.CGO TATGACG FCAICGEGTCC TCTOTC SFP09 RS5 RNACCATCAC GCOATO FATALGCACCGG ATAA SFP10 G ORS RTGCAAGGTATCCA Ay TCAACCGAAGA SFP11 OR CCTEATGCTGAG AGGKAA EACATCCATCACAG CTT SFP12 OR AGATTTGAG TGTTO SFP13 VODO CAGTTCC SFP14 R LGL FGCAGTA AGATC A OGCO ATNTG SFP15 ORS STATATTGC TTT IGA U TCT SFP16 ORSIN ACCTTGT ITGGAG ACTCA TGTTG SFP17 ORS170 GI R.TGTGATGATTG GGATTGGAG TACAACGTGC ATTTGTTCTAT SFP18 ORS943 R:CCAGGTT AGCCTTTTGTATT F:GAC ATGAGACCCAAACTG SFP19 ORS229 LG2/5 R:TCCGACCCGAATCTTATGAACC F:GCCCAAGATGTGAAGCGAATG SFP20 ORS203 LG2/17 55 R:GTCAGAACAGGACCGAACCACT 55 F:CCCATTCACTCCTGTTTCCA SFP21 ORS488 LG3 R:CTCCGGTGAGGATTTGGATT F:GCACATGAGGTATGGATCTCCT SFP22 ORS665 LG3/16 55 R:TGCAAATACAACTCGGGAAA F:GTGTGAATGTGAGTGTGAATCC SFP23 HA1258 LG4 55 R:GTCACAGTTGCATATCCATCC SFP24 F:AGGAAAGAAGGAAGCCGAGA ORS533 LG5