ICS 65.020.01 B 20 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3751—2020 高梁品种纯度鉴定 SSR分子标记法 Sorghum (Sorghum bicolor L.)variety purity testing-SSR-based methods 2020-11-12发布 2021-04-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3751—2020 目 次 前言 范围 2 规范性引用文件 3 术语和定义 缩略语 5 原理· 检测方案 7 试剂及溶液配制 8 仪器设备 9 检测程序 10 结果计算与表示 11 结果报告 附录A（资料性附录） 溶液配制 附录B（资料性附录） 品种鉴定位点信息 10 NY/T3751—2020 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不应承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部种业管理司提出。 本标准由全国农作物种子标准化技术委员会（SAC/TC37)归口。 本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、吉林省农业科学院、吉林省种子管理总站、山西省农业 种子总站、辽宁省农业发展服务中心、江西省种子管理局。 本标准主要起草人：周泽宇、张春宵、刘丰泽、李晓辉、晋芳、李淑芳、金石桥、支巨振、班秀丽、李巧英、 李建红、傅友兰、李波。 II NY/T3751—2020 高梁品种纯度鉴定 SSR分子标记法 1范围 本标准规定了高粱（SorghumbicolorL.）品种纯度鉴定SSR分子标记法的术语和定义、缩略语、原 理、检测方案、试剂及溶液配制、仪器设备、检测程序、结果计算与表示和结果报告。 本标准适用于高梁杂交种和常规种纯度鉴定 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应厂 用是必不可少的。 凡是不注日期的引用文件， GB/T3543.1农作物种 检验规程 GB/T3543.2 农作物利 子检验 GB/T3543.5 表作物种子检验规程 真实性和品种纯度鉴定 GB/T6682 分析实验用水 规格和试验方法 S 3术语和定义 下列术语和定 3.1 引物prime 条互补结合在 莫板DN NA链主的短单链能提供3'-OH未端作为DNA合成的起始 延伸合成模 板DNA的互补链 CEI 3. 2 组合引物 panel C Z 能够组合在一起电泳的标记不 相同颜色荧光而扩增片段大小 R 4缩略语 下列缩略语适用于本 bp：碱基对（Basepair） CTAB：十六烷基三甲基漠化铵（CetyltimethylammoniumBromide） DNA：脱氧核糖核酸(Deoxyribonu leicAcid dNTPs：脱氧核苷三磷酸（DeoxyribonucleosideTriphosphat PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳（PolyacrylamideGelElectrophoresis) PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction） SSR：简单序列重复（SimpleSequenceRepeat) Taq酶：耐热DNA聚合酶（Taq-DNAPolymerase) 5原理 高梁不同品种的基因组存在着能够世代稳定遗传的简单序列重复的重复次数差异。这种差异可以通 过从有代表性的检测样品中提取DNA，用SSR引物进行扩增和电泳，检测其扩增产物片段大小区分 依据SSR分子标记检测原理，采用筛选出的能够准确识别品种非典型个体的适宜引物，对一定数量 送验样品的典型个体数目或百分率进行估测，从而对样品整体的典型一致程度作出评价。 1 NY/T3751—2020 6检测方案 6.1通则 引物、检测平台、样品状况不同，其检测结果准确度、精确度可能有所不同。应依据“适于检测目的”的 原则，统筹考虑检测规模和检测能力，择定适宜的引物、检测平台、样品状况，制订相应的检测方案。 在严格控制条件下，合成选择的引物，按照确定的检测平台对检测样品按DNA提取、PCR扩增、电 泳、数据分析的程序进行检测。 按规定要求填报检测结果，结果报告应注明影响检测结果的关键信息。 品种纯度鉴定，必要时应先对该品种进行真实性鉴定。 6.2样品 6.2.1送验样品重量应符合GB/T3543.2的要求。 6.2.2从送验样品中分取规定数量的试样，试样的分取符合GB/T3543.2的要求。一般推荐检测不少 于100粒种子样品，常规大由用种和原种试样可采用混合样或单粒独立检测，杂交种单粒独立检测。如要 求更为准确的估测品种纯度，试样数量应符合GB/T3543.5规定的4N原则。 6.3引物 6.3.1非典型个体的类型不同，所选引物和数日也有所不同。 6.3.2常规种纯度测定可采用10个SSR位点同时检测所有个体，也可以通过混合样品试验，筛选混合 样品中杂合的SSR位点进行检测；杂交种纯度测定需要通过混合样品试验，筛选混合样品中杂合的SSR 位点进行检测。在检测过程中，当需要对样品同时进行真实性检测的，按高品种鉴定的规定进行真实性 验证或身份鉴定；当样品在个别位点存在遗传不稳定状况的，可将该位点剔除；当检测样品在被检位点中 有5个以上位点存在严重遗传不稳定状况的，可终止纯度检测。 6.4检测平台 电泳是检测平台中的关键环节，由于纯度检测样品数量大，纯度鉴定可以采用毛细管电泳，在选择等 位基因扩增片段差异较大的引物前提下也可采用常规的变性PAGE垂直板电泳或琼脂糖水平电泳。对 于检测样品量较大的，可将组织研磨仪、DNA自动提取和移液工作站、高通量PCR扩增仪、多引物组合的 毛细管电泳进行组合，提高检测的综合效率。DNA提取、PCR扩增、电泳的技术条件要求，在适于检测目 的和不影响检测质量的前提下，按照检测平台的要求充许对本文本的规定作适宜的局部调整 6.5检测条件 纯度测定应在有利于检测正确实施的控制条件下进行，包括但不限于下列条件： a） 种子检验员具备熟悉所使用检测技术的知识和技能； b) 所有仪器与使用的技术相适应，并已经过定期维护、验证和校准； c） 使用适当等级的试剂和灭菌处理的耗材； d) 使用校准影响检测结果评定的适宜参照样品。 7试剂及溶液配制 7.1试剂 7.1.1DNA提取 CTAB、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2·2H2O）、三羟甲基氨基甲烷（Tris base）、盐酸、氢氧化钠、氯化钠、β-巯基乙醇（β-Mercaptoethanol）、乙醇（70%）、无水乙醇。 7.1.2PCR扩增 dNTPs、Taq酶、10X缓冲液、ddH2O和Mg2+或者2XTaqMix反应混合液。 7.1.3电泳 7.1.3.1毛细管电泳 2 NY/T3751—2020 与DNA分析仪型号相匹配的分离胶、分子量内标、去离子甲酰胺、电泳缓冲液、 7.1.3.2变性PAGE垂直板电泳 去离子甲酰胺（Formamide）、溴酚蓝（BromophenolBlue）、二甲苯青、甲叉双丙烯酰胺（Bisacrylam ide）、丙烯酰胺（Acrylamide）、硼酸（BoricAcid）、尿素、亲和硅烷（BindingSilane）、疏水硅烷（RepelSi lane）、DNA分子量标准、无水乙醇、四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵（APS）、冰醋酸、乙酸铵、硝酸银、 甲醛、氢氧化钠。 7.2溶液配制 DNA提取、PCR扩增、电泳、银染的溶液参照附录A规定的要求进行配制，所用试剂均为分析纯。 试剂配制所用水应符合GB/T6682规定的一级水的要求，其中银染溶液的配制可以使用符合三级水 要求的水。 8仪器设备 8.1DNA提取 RD 高速冷冻离心机、水浴锅或 8.2PCR扩增 PCR扩增仪或水浴PCR扩增装 8.3电泳 8.3.1毛细管电泳 S DNA分析仪 8.3.2变性PAGE垂直板电 高压电泳仪 板电泳 槽及制胶附件、胶片戏 胶成像系统 成数码本 8.4其他器具 微量移液器、电 天平、高压火菌锅、磁力搅拌器冰箱、染色 9检测程序 9.1引物的筛选和合 9.1.1对于高粱常 纯度测 体混杂个体的采用本标准推荐 分析被检个体 的基因型；对于高梁杂 交个体异交个体混杂全 采取 合DNA样品 筛选3对以上杂合位点的 SR引物用筛选的SSR引物分析被检个体的基因型。 交种时可用双亲 作为对照。不同类型非典型 体的基因型判断可依据以下规则进行确定 a）对于鉴定自交个体，识别特征为母本具有该等位基因而父本缺失； b) 对于鉴定异交个体，识别特征为母本具有该等位基因而交本错误： 对于鉴定混杂个体，识别特征为父本具有该等位基因而母本错误或父母本都不具有。 注：筛选引物时每5个样品混合。 他适宜的引物进行纯度鉴定，并依据6.3和9.1.1的要求，确定适宜的引物或引物组合。 表1 品种纯度鉴定推荐引物 染色体 扩增片段范围 编号 引物名称 引物序列（5'-→3'"） 标记荧光 位置 bp 正向：AGCATCTTACAACAACCAAT LC1-01 SBKAFGK1 SBI05 118~137 蓝 反向：CTAGTGCACTGAGTGATGAC 正向：AGTCAAAACCGCCACAT LC1-02 Txp168 SBI07 176~180 蓝 反向：GAGAAGGGGAGAGGAGAA 3 NY/T3751—2020 表1 (续) 染色休 扩增片段范围 编号 引物名称 引物序列（5-3'） 标记荧光 位置 bp 正向：GCGTATGAATCTTCGTTTTATTCA LC1-03 Txp426 SBI03 240~252 蓝 反向：CCATCATTTTGATGAAATGCAC