ICS 65.020.01 B 20 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3750—2020 玉米品种纯度鉴定 SSR分子标记法 Maize(Zea mays L.)variety purity testingSSR-based methods 2020-11-12发布 2021-04-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3750—2020 目 次 前言 范围 2 规范性引用文件 3 术语和定义 缩略语· 5 原理 6 检测方案 试剂和溶液配制 8 仪器设备 9 检测程序 10 结果计算与表示 11 结果报告： 附录A（资料性附录） 溶液配制 附录B(资料性附录) 真实性鉴定程序 附录C(资料性附录) 等位变异扩增片段信息 附录D(资料性附录) 40对SSR引物标记四色荧光引物分组方案 NY/T3750—2020 前 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不网承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部种业管理司提出。 本标准由全国农作物种子标准化技术委员会（SAC/TC37）归口。 本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、陕西省农作物种子检验站、北京玉米种子检测中心、甘 肃省农作物种子质量监督检测中心、辽宁省农作物种子质量监督检验测试中心。 本标准主要起草人：金石桥、张英、周泽宇、晋芳、支巨振、赵建宗、张力科、刘丰泽、傅友兰、刘冰、王凤 格、易红梅、戴铮、朱志成。 NY/T3750—2020 玉米品种纯度鉴定 SSR分子标记法 1范围 本标准规定了玉米（ZeamaysL.)品种纯度SSR分子标记方法的术语和定义、缩略语、原理、检测方 案、试剂和溶液配制、仪器设备、检测程序、结果计算与表示和结果报告。 本标准适用于玉米品种纯度鉴定。 2 规范性引用文件 件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本包括所有的修 GB/T3543.1 农作物种 中子检验规种 GB/T3543.2 衣作物 种子检 GB/T3543.5 农作物种子检验规程 真实性和品种纯度鉴 GB/T 6682 分析 S 3术语和定义 下列术语和定 适用子 3. 1 R 引物 primer U 条互补结合 模板 PNA链工的短单 成的起女 延伸合成模 板DNA的互补链 3. 2 组合引物 pane 能够组合在 动颜色而护增 3. 3 U 等位基因 allele 在一对同源染色体上 基因座上 注1：对于SSR检测，等位基因差异以扩增 注2：对于荧光标记引物，扩增产物片段大小是指 定 没天小的区间范围，本标准将之称为Bin。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对（basepair) CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammoniumbromide） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) dNTPs：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphates） PAGE：聚内烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） SDS：十二烷基苯磺酸钠（sodiumdodecylsulfate） SSR：简单序列重复（simplesequencerepeat） Taq酶：耐热DNA聚合酶（Taq-DNApolymerase) 1 NY/T3750—2020 5原理 玉米的不同品种，其基因组存在着能够世代稳定遗传的简单序列重复（SSR）的重复次数差异。这种 差异可以通过从抽取有代表性的检测样品中提取DNA，用SSR引物进行扩增和电泳，通过检测其扩增产 物片段大小而加以区分。 分率进行测算，从而对样品整体的典型一致程度作出评价。 6检测方案 6.1总则 样品状况、引物、检测平台不同，其检测结果准确度、精确度可能有所不同。应依据“适于检测目的”的 原则，统筹考虑检测规模和检测能力，选定适宜的样品数量、引物、检测平台，制订相应的检测方案。 泳、数据分析的程序进行检测。 按规定要求填报检测结果，检验报告应注明影响检测结果的关键信息。 品种纯度鉴定，必要时应先对该品种进行真实性鉴定。 6.2样品 6.2.1送验样品重量应不低于1000g。 6.2.2从送验样品中随机分取规定数量的试样，试样的分取符合GB/T3543.2的规定。试样不少于 100粒种子，对于自交系，试样可采用混合样或单粒独立检测。杂交种宜单粒独立检测。检测样品可以是 种子、胚芽、幼苗或叶片。 6.3引物 6.3.1非典型个体的类型不同，所选引物和数目也有所不同。 6.3.2所选的引物，应通过检测样品预试验，能够准确识别该样品的非典型个体。筛选时还需综合考虑 引物的杂合度、DNA快速提取和多重组合电泳的潜力。预试验结果表明，样品在个别位点存在遗传不稳 定状况的，可将该位点剔除；检测样品存在严重遗传不稳定状况的，可终止纯度鉴定 6.4检测平台 6.4.1扩增产物可采用变性PAGE垂直板电泳、荧光毛细管电泳、琼脂糖电泳，若采用琼脂糖电泳，选择 等位基因扩增片段差异较大的引物 6.4.2对于样品量较大的，可将样品粉碎仪、DNA自动提取和移液工作站、高通量PCR扩增仪、多引物 组合的毛细管电泳进行组合，以提高检测的综合效率。 6.4.3DNA提取、PCR扩增、电泳的技术条件要求，在适于检测目的和不影响检测质量的前提下，按照 检测平台的要求允许对本标准的规定作适当调整。 6.5检测条件 应在有利于检测有效实施的控制条件下进行，包括但不限手下列条件： a） 种子检验员具备熟悉所使用检测技术的知识和技能； b）所有仪器与使用的技术相适应，并已经过定期维护、验证和校准； c) 使用适当等级的试剂和灭菌处理的耗材； d) 使用校准影响检测结果评定的适宜参照样品。 7试剂和溶液配制 7.1试剂 7.1.1DNA提取 2 NY/T3750—2020 CTAB、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2·2H2O)、三羟甲基氨基甲烷（Tris base)）、盐酸、氢氧化钠、氯化钠、β-基乙醇（β-Mercaptoethanol）、乙醇（70%）、SDS、无水乙醇。 7.1.2PCR扩增 引物、DNA、dNTPs、Taq酶、10X缓冲液、ddH,O和Mg2+或者Mix反应混合液。 7.1.3电泳 7.1.3.1荧光毛细管电泳 DNA分析仪专用的丙烯酰胺胶、分子量内标、去离子甲酰胺、电泳缓冲液。 7.1.3.2变性PAGE垂直板电泳 去离子甲酰胺（Formamide）、溴酚蓝（BromophenolBlue） 甲苯青、甲叉双丙烯酰胺（Bisacrylam ide）、丙烯酰胺（Acrylamide）、硼酸（BoricAcid）、尿素，亲和硅烷（BindingSilane）、疏水硅烷（RepelSi lane）、DNA分子量标准、无水乙醇、四甲基乙 ED）、过硫酸铵（APS）、冰醋酸、乙酸铵、硝酸银、 甲醛、氢氧化钠。 7.1.3.3琼脂糖凝胶电泳 7.2溶液配制 DNA提取、PCR扩 增电永 以使用符合三级要求 的水。 SEARCH JRAL 8仪器设备 8.1DNA提取 高速冷冻离心 广光光度计或核酸浓度测定仪 8.2PCR扩增 PCR扩增仪或 8.3电泳 8.3.1毛细管电 DNA分析仪 R 8.3.2变性PAGE垂直板电泳 高压电泳仪、垂直电泳 摇床 胶压观察灯凝胶成像系统 码相机。 8.3.3琼脂糖凝胶电泳 电泳仪、水平电泳槽及制胶附件、凝胶成 统或 8.4其他器具 微量移液器、电子天平、高压灭菌锅、磁力搅拌器、微波炉、冰箱、染色盒等。 9检测程序 9.1 引物筛选 9.1.1针对杂交种品种纯度不同类型非典型个体的引物筛选，可参照下列规则进行确定： a) 对于鉴定自交个体，识别特征为该等位基因具有母本而父本缺失，筛选2对以上能检测杂合位点 （通常表现为双亲互补带）的引物； b) 对于鉴定异交个体，识别特征为该等位基因具有母本而父本错误，在具备父母本对照或其SSR 指纹数据的条件下，筛选2对以上的引物； c) 对于鉴定混杂个体，识别特征为该等位基因具有父本而母本错误或不具有父母本，在具备父母本 对照或其SSR指纹数据的条件下，筛选2对以上的引物； 3 NY/T3750—2020 d）对于同时鉴定自交、异交、混杂个体或者其中两者的，应综合考虑筛选3对以上的引物。 对于自交系品种纯度鉴定，鉴定异交个体、混杂个体的，各需筛选3对以上的引物，或者采用本标准推 荐的所有引物分析被检个体的基因型， 9.1.2本标准推荐了8对品种纯度鉴定引物（见表1)，作为优先筛选的推荐引物。筛选时，可用至少含 20粒的小样品进行试验，依据6.2和9.1.1的要求，确定适宜的引物或引物组合。推荐8对引物仍未达 到筛选效果的，可选择附录B中表B.1另外32对引物或其他引物进行筛选。 表1纯度鉴定推荐引物 染色体 荧光 扩增片段 编号 引物名称 引物序列（5'-3'") 杂合度 位置 颜色 范围，bp 正向：AGTTGACATCGCCATCTTGGTGAC PM01 bnlg439w1 1. 03 黄色 320~368 0.83 反向：GAACAAGCCCTTAGCGGGTTGTC 正向：TTTTGCACGAGCCATCGTATAACG PM23 phi96100yl 2.00 蓝色 245~277 0.62 反向：CCATCTGCTGATCCGAATACCC 正向：GCACA