ICS 65.020.01 B 20 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T3749—2020 普通小麦品种纯度鉴定 SSR分子标记法 Wheat(Triticum aestivum L.)varietal purity testing-SSR-based methods 2020-11-12发布 2021-04-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3749—2020 目 次 前言 范围 2 规范性引用文件 3 术语和定义 4 缩略语· 5 原理 6 检测方案 7 试剂和溶液配制 8 仪器设备 9 检测程序 10 结果计算与表示 11结果报告… 附录A（资料性附录） 溶液配制 附录B(资料性附录) 真实性鉴定程序 附录C(资料性附录) 等位变异扩增片段信息 附录D(资料性附录) 42对SSR引物标记四色荧光引物分组方案 NY/T3749—2020 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部种业管理司提出。 本标准由全国农作物种子标准化技术委员会（SAC/TC37）归口。 本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、北京市农林科学院北京杂交小麦工程技术研究中心、 督检验站。 本标准主要起草人：赵昌平、周泽宇、庞斌双、金石桥、刘丽华、张力科、晋芳、支巨振、赵建宗、傅友兰、 刘丰泽、刘阳娜、史庆玲、李承宗、李宏博、孟全业、李延坤。 II NY/T3749—2020 普通小麦品种纯度鉴定 SSR分子标记法 1范围 本标准规定了普通小麦（TriticumaestivumL.）品种纯度SSR分子标记方法的术语和定义、缩略语、 原理、检测方案、试剂和溶液配制、仪器设备、检测程序、结果计算与表示和结果报告。 本标准适用于普通小麦品种纯度鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件， 最新版 GB/T3543.1农作 利 检验规栓 GB/T3543.2 农 4物 千木 检验规程 GB/T3543.5 实性和品种纯度 GB/T6682 验室财水 规格租 术语和定义 S 下列术语和定 适用甲本 RA 3. 1 引物primer ·条互补结 合 模板 延伸合成模 板DNA的互补链 工 3. 2 组合引物 pane 能够组合在 或相同颜色荧光而护增片围 缩略语 下列缩略语适用于 bp：碱基对（basepa CTAB：十六烷基三甲为 化铵（cety hylanmo romide DNA：脱氧核糖核酸（deox ribonucleic dNTPs：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphates） PAGE：聚内烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction SDS：十二烷基磺酸钠（sodiumdodecylsulfate） SSR：简单序列重复（simplesequencerepeat） Taq酶：耐热DNA聚合酶（Taq-DNApolymerase) 5原理 普通小麦的不同品种，其基因组存在着能够世代稳定遗传的简单序列重复（SSR)的重复次数差异。 这种差异可以通过从抽取有代表性的检测样品中提取DNA，用SSR引物进行扩增和电泳，通过检测其扩 增产物片段大小而加以区分。 采用经筛选能准确识别品种异常个体指纹的适宜引物，对一定数量送验样品的正常个体数目或百分 1 NY/T3749—2020 率进行测算，从而对样品整体的典型一致程度作出评价。 6检测方案 6.1总则 样品状况、引物、检测平台不同，其检测结果准确度、精确度可能有所不同。应依据“适于检测目的”的 原则，统筹考虑检测规模和检测能力，选定适宜的样品数量、引物、检测平台，制订相应的检测方案。 泳、数据分析的程序进行检测。 品种纯度鉴定，必要时应先对该品种进行真实性鉴定 6.2样品 6.2.1送验样品为种子，重量应不低于500g。 6.2.2从送验样品中随机分取规定数量的试样，试样的分取应符合GB/T3543.2的规定。试样不少于 100粒种子，检测样品可以是种子、胚芽、幼苗或叶片。 6.3引物 6.3.1非典型个体的类型不同，所选引物和数目也有所不同。 混合样品中杂合的SSR位点进行检测；杂交种品种纯度测定需要通过混合样品试验，筛选混合样品中杂 6.4检测平台 6.4.1扩增产物可采用变性PAGE垂直板电泳、毛细管电泳。 6.4.2对于检测样品量较大的，可将组织研磨仪、DNA自动提取和移液工作站、高通量PCR扩增仪、多 引物组合的毛细管电泳进行组合，提高检测的综合效率。 6.4.3DNA提取、PCR扩增、电泳的技术条件要求，在适于检测目的和不影响检测质量的前提下，按照 检测平台的要求允许对本标准的规定进行适当调整。 6.5检测条件 纯度测定应在有利于检测有效实施的控制条件下进行，包括但不限于下列条件： 种子检验员具备熟悉所使用检测技术的知识和技能； 所有仪器与使用的技术相适应，并已经过定期维护、验证和校准； 一一使用适当等级的试剂和灭菌处理的耗材： 使用校准影响检测结果评定的适宜参照样品 7试剂和溶液配制 7.1试剂 7.1.1DNA提取 CTAB、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2·2H2O）、三羟甲基氨基甲烷（Tris base）、盐酸、氢氧化钠、氯化钠、β-巯基乙醇（β-Mercaptoethanol）、乙醇（70%）、SDS、无水乙醇。 7.1.2PCR扩增 dNTPs、Taq酶、10X缓冲液、ddHzO和Mg²+或者2XTaqMix反应混合液。 7.1.3电泳 7.1.3.1毛细管电泳 与遗传分析仪型号相匹配的分离胶、分子量内标、去离子甲酰胺、电泳缓冲液。 7.1.3.2变性PAGE电泳 2 NY/T3749—2020 去离子甲酰胺（Formamide）、溴酚蓝（BromophenolBlue）、二甲苯青、甲叉双丙烯酰胺（Bisacrylam ide）、丙烯酰胺（Acrylamide）、硼酸（BoricAcid）、尿素、亲和硅烷（BindingSilane）、疏水硅烷（RepelSi lane）、DNA分子量标准、无水乙醇、四甲基乙二胺（TEMED)、过硫酸铵（APS）、冰醋酸、乙酸铵、硝酸银、 甲醛、氢氧化钠。 7.2溶液配制 DNA提取、PCR扩增、电泳、银染的溶液参照附录A规定的要求进行配制，所用试剂均为分析纯。 试剂配制所用水应符合GB/T6682规定的一级水的要求，其中银染溶液的配制可以使用符合三级水 要求的水。 8 仪器设备 8.1DNA提取 分光光度计或核酸浓度测定仪、组织研 磨仪。 8.2PCR扩增 8.3电泳 8.3.1毛细管电池 DNA分析仪 S 8.3.2变性PAGE 垂直板电 高压电泳仪 直板更酒 槽及制胶附性胶工观察 系价 充或数码 R 8.4其他器具 微量移液器 子天 高 9 检测程序 CE 9.1引物的合成和筛 9.1.1对于普通 规利 鉴定异 体、 杂个体的采用本 示准推 所有引物分析 被检个体的基因型 首鱼 混杂个体，采取 用混合DNA样品筛 ！ 的基因型。不同 类型异常个体的基因型 断可依 对于鉴定自交 识别特征为母本 有该 b) 对于鉴定异交个体 等位基因而父 水错误： 对于鉴定混杂个体，识 征为父本具有该等位基因而母本错误或父 父母本都不具有。 c) 9.1.2 本标准推荐了10对品种纯度 引物（见表1），特殊情况 可以选取附录B表B.1的其他引物 或其他适宜的引物进行纯度鉴定，根据6.3和9.1.1的要求.确 定适宜的引物或引物组合。 表1 品种纯度鉴定推荐引物 染色体 编号 扩增片段 引物名称 引物序列(5'-3'") 荧光颜色 位置 范围，bp 正向：GCGAATTAGCATCTGCATCTGTTTGAG PM02 barc80 1BL, 97~119 黑色 反向：CGGTCAACCAACTACTGCACAAC 正向：CCAATTCTGCCCATAGGTGA PM27 barc324 3AS 227~255 黑色 反向：GAGGAAATAAGATTCAGCCAACTG 正向：TGCAAACTAATCACCAGCGTAA PM28 barc164 3BS 175~211 黑色 反向：CGCTTTCTAAAACTGTTCGGGATTTCTAA 3 NY/T3749—2020 表1 (续) 染色体 编号 扩增片段 引物名称 引物序列（5'-→3') 荧光颜色 位置 范围，bp PM19 cfa2028 236~260 正向：TGGGTATGAAAGGCTGAAGG 7AS 红色 反向：ATCGCGACTATTCAACGCTT PM30 gwm161 150~174 正向：GATCGAGTGATGGCAGATGG 3DS 红色 反向：TGTGAATTACTTGGACGTGG PM10 166~176 正向：CTGCCTTCTCCATGGTTTGT gwm610 4AS 蓝色 反向：AATGGCCAAAGGTTATGAAGG PM40 正向：CGGTCTTTGTTTGCTCTAAACC cfa2123 7AS 241~254 蓝色 反向：ACCGGCCATCTATGATGAAG PM04 68~104 正向：GGATTGGAGTTAAGAGAGAACCG gwm294 2AL 绿色 反向：GCAGAGTGATCAATGCCAGA PM07 正向：CAATCATTTCCCCCTCCC gwm1