ICS65.020.01 B 20 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3748—2020 水稻品种纯度鉴定 SSR分子标记法 Rice(Oryza sativa L.)varietal purity testing-SSR-based methods 2020-11-12发布 2021-04-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3748—2020 目 次 前言 范围 2 规范性引用文件 3 术语和定义 4 缩略语· 5 原理· 6 检测方案 试剂和溶液配制 8 仪器设备 9 检测程序 10 结果计算与表示 11 结果报告. 附录A（资料性附录） 溶液配制 附录B（资料性附录） 真实性鉴定程序 10 附录C资料性附录） 等位变异扩增片段信息 15 附录D（资料性附录）48对SSR引物标记四色荧光引物分组方案 24 NY/T3748—2020 K 前 全国农壹食品标准 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。1 请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不应承担识别这些专利的责任， 本标准由农业农村部种业管理司提出。 本标准由全国农作物种子标准化技术委员会（SAC/TC37）归口。 圳）、四川省种子质量监督检验站、湖北省农作物种子质量监督检验测试中心、中国水稻研究所、安徽省种 子质量监督检验站。 本标准主要起草人：周泽宇、李筠、金石桥、支巨振、赵建宗、张力科、晋芳、刘丰泽、傅友兰、邓汉超、莫 洁华、周会、高明鑫、徐群、曹玉洁。 II NY/T3748—2020 水稻品种纯度鉴定 SSR分子标记法 1范围 本标准规定了水稻（OryzasatiuaL.）品种纯度SSR分子标记方法的术语和定义、缩略语、原理、检测 方案、试剂和溶液配制、仪器设备、检测程序、结果计算与表示和结果报告。 本标准适用于水稻品种纯度鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 GB/T3543.2农作物种 平检验规程 GB/T3543.5 农作物 品种 GB/T6682 金室用水规格和试 3术语和定义 S 下列术语和定义适 适用于本 3. 1 RA 引物primer -条互补结合在 车上的短单链，能换 供3'-OHL未端作为DNA合成 延伸合成模 板DNA的互补链 工 3. 2 组合引物 panel 能够组合在 一起电 泳的 色或相同颜色荧光而 增片段 同店 4缩略语 R 下列缩略语适用于 bp：碱基对（basepair CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammon mbromide DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid） dNTPs：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphates) PAGE：聚内烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectroph PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreacti SDS：十二烷基磺酸钠（sodiumdodecylsulfate） SSR：简单序列重复（simplesequencerepeat） Taq酶：耐热DNA聚合酶（Taq-DNApolymerase） 5原理 水稻的不同品种，其基因组存在着能够世代稳定遗传的简单序列重复（SSR)的重复次数差异。这种 差异可以通过从抽取有代表性的检测样品中提取DNA，用SSR引物进行扩增和电泳，通过检测其扩增产 物片段大小而加以区分。 采用经筛选能够准确识别品种异常个体指纹的适宜引物，对一定数量送验样品的正常个体数日或百 1 NY/T3748—2020 分率进行测算，从而对样品整体的典型一致程度作出评价。 6检测方案 6.1总则 样品状况、引物、检测平台不同，其检测结果准确度、精确度可能有所不同。应依据“适于检测目的”的 原则，统筹考检测规模和检测能力，选定适宜的样品数量、引物、检测平台，制订相应的检测方案。 泳、数据分析的程序进行检测 按规定要求填报检测结果，检验报告应注明影响检测结果的关键信息。 品种纯度鉴定，必要时应先对该品种进行真实性鉴定。 6.2样品 6.2.1送验样品为种子，重量应不低于500g。 6.2.2从送验样品中随机分取规定数量的试样，试样的分取应符合GB/T3543.2的要求。试样不少于 100粒种子，对于常规种和不育系、保持系，试样可采用混合样或单粒独立检测。杂交种宜单粒独立检测。 检测样品可以是种子、胚芽、幼苗或叶片。 6.3引物 6.3.1非典型个体的类型不同，所选引物和数目也有所不同。 6.3.2品种纯度测定需要通过预实验，利用20个单个个体筛选具有杂合的SSR位点进行检测。当样品 在个别位点存在遗传不稳定状况的，可将该位点剔除；检测样品存在严重遗传不稳定状况的，可终止纯度 鉴定。 6.4检测平台 6.4.1扩增产物可以选择毛细管电泳、PAGE垂直板电泳、琼脂糖电泳。若采用琼脂糖电泳，选择等位基 因扩增片段差异较大的引物。在选择等位基因扩增片段差异较大的引物前提下也可采用琼脂糖电泳。 6.4.2对于检测样品量较大的，可将组织研磨仪、DNA自动提取和移液工作站、高通量PCR扩增仪、多 引物组合的毛细管电泳进行组合，提高检测的综合效率。 6.4.3DNA提取、PCR扩增、电泳的技术条件要求，在适于检测目的和不影响检测质量的前提下，按照 检测平台的要求允许对本标准的规定进行适当调整。 6.5检测条件 纯度测定应在有利于检测有效实施的控制条件下进行，包括但不限于下列条件： a) 种子检验员具备熟悉所使用检测技术的知识和技能； b）所有仪器与使用的技术相适应，并已经过定期维护、验证和校准； c) 使用适当等级的试剂和灭菌处理的耗材； d) 使用校准影响检测结果评定的适宜参照样品。 7试剂和溶液配制 7.1试剂 7.1.1DNA提取 base）、盐酸、氢氧化钠、氯化钠、β-硫基乙醇（β-Mercaptoethanol）、乙醇（70%）、无水乙醇。 7.1.2PCR扩增 dNTPs、Taq酶、10X缓冲液、ddHzO和Mg2+或者2XTaqMix反应混合液。 7.1.3电泳 7.1.3.1毛细管电泳 2 NY/T3748—2020 与遗传分析仪型号相匹配的分离胶、分子量内标、去离子甲酰胺、电泳缓冲液， 7.1.3.2PAGE垂直板电泳 去离子甲酰胺（Formamide）、溴酚蓝（BromophenolBlue）、二甲苯青、甲叉双丙烯酰胺（Bisacrylam ide）、丙烯酰胺（Acrylamide）、硼酸（BoricAcid）、尿素、亲和硅烷（BindingSilane）、疏水硅烷（RepelSi lane）、DNA分子量标准、无水乙醇、四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵（APS）、冰醋酸、乙酸铵、硝酸银、 甲醛、氢氧化钠。 7.1.3.3琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖、溴酚蓝、核酸染色剂（Goldview或溴化乙锭）。 7.2溶液配制 DNA提取、PCR扩增、电泳、银染的溶液参照附录A的规定进行配制，所用试剂均为分析纯 试剂配制所用水应符合GB/T6682规定的一级水的要求,其中银染溶液的配制可以使用符合三级水 要求的水。 8仪器设备 8.1DNA提取 Q 高速冷冻离心机 水浴 属浴、紫外分光光度计或 酸浓 研磨仪。 8.2PCR扩增 PCR扩增仪或水浴 PCg 8.3电泳 RAL 8.3.1毛细管电泳 DNA分析仪 8.3.2PAGE垂直板月 电泳 高压电泳仪 板电泳 或数码相机 8.3.3琼脂糖凝胶电 泳 电泳仪、水平电泳 8.3.4其他器具 微量移液器、电子 器冰箱、 9检测程序 U 9.1DNA提取 9.1.1总则 DNA提取方法应保证提取的DNA质量付 PCR扩增 求，DNA无降解。 DNA提取可参考9.1.2、9.1.3和9.1.4的方法，也可采用其他能够达到DNA质量和PCR扩增质量 要求的DNA提取方法。 9.1.2CTAB法 取试样的个体种子、幼苗或叶片200mg～300mg置于2.0mL离心管，充分研磨。每管加入700ul 经65℃预热的CTAB提取液，充分混合，65℃水浴60min，其间多次颠倒混匀。每管加入等体积的氯仿 异戊醇（24：1)混合液，充分混合后静置10min，10000g离心15min。吸取上清液转移至一新管，加入 2/3倍体积预冷的异丙醇，颠倒混勾，4℃、10000g离心10min，弃上清液，用70%乙醇溶液洗涤2遍，室 温自然晾干后，加入TE缓冲液，充分溶解，检测浓度后备用。 9.1.3快速抽提法 取试样的叶片置于2.0mL离心管，加入200μL快速抽提提取液充分研磨后，取研磨后的样品置于 96孔PCR板上，放置于PCR仪上温浴，水浴程序为先37℃30min，后95℃3min；离心后放在4℃冰箱 3 NY/T3748—2020 备用。 9.1.4试剂盒法 选用适宜SSR分子标记法的商业试剂盒，并经验证合格后使用。DNA提取方法，按照提供的使用说 明进行操作。 9.2引物的合成和筛选 9.2.1对于水稻常规种的品种纯度测定，鉴定异交个体、混杂个体的，采用本标准推荐的所有引物分析被 检个体的基因型；对于水稻杂交种的品种纯度测定，主要是鉴定自交个体（不育系、保持系）、异交个体、混 杂个体，需要用20粒的小样品进行试验，筛选2对以上杂合位点的SSR引物，用筛选到的SSR引物分析 被检个体的基因型。 针对杂交种品种纯度不同类型非典型个体的引物筛选，按照下列规则进行确定： a）对于鉴定自交个体（不育系、保持系），识别特征为该等位基因