书 书 书犐犆犛 ６５ ． １２０ 犅 ４６ 　 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 １９３７１ ． ２ — ２００７ 代替 ＧＢ ／ Ｔ１９３７１．２ — ２００３ 饲料中蛋氨酸羟基类似物的测定 高效液相色谱法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犿犲狋犺犻狅狀犻狀犲犺狔犱狉狅狓狔犪狀犪犾狅犵狌犲犻狀犳犲犲犱狊 — 犎犻犵犺狆犲狉犳狅狉犿犪狀犮犲犾犻狇狌犻犱犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺狔 ２００７  ０６  ２１ 发布 ２００７  ０９  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准是 ＧＢ ／ Ｔ１９３７１．２ — ２００３ 《 饲料中液态蛋氨酸羟基类似物的测定 　 高效液相色谱法 》 的修 订版 。 本标准与 ＧＢ ／ Ｔ１９３７１．２ — ２００３ 的主要差异如下 ： ——— 对标准名称的修改 ， 由 “ 饲料中液态蛋氨酸羟基类似物的测定 ” 改为 “ 饲料中蛋氨酸羟基类似物 的测定 ”。 ——— 对测定范围的修改 ， 在范围中增加了预混料中羟基蛋氨酸钙的测定 。 ——— 对结果计算的修改 ， 增加了羟基蛋氨酸钙的计算公式 。 ——— 将最低检出量规范为最低定量限 。 本标准自实施之日起代替 ＧＢ ／ Ｔ１９３７１．２ — ２００３ 。 本标准由中华人民共和国农业部提出 。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口 。 本标准起草单位 ： 国家饲料质量监督检验中心 （ 北京 ）。 本标准主要起草人 ： 闫惠文 、 赵小阳 、 索德成 、 怀明燕 。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为 ： ——— ＧＢ ／ Ｔ１９３７１．２ — ２００３ 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 １９３７１ ． ２ — ２００７ 饲料中蛋氨酸羟基类似物的测定 高效液相色谱法 １ 　 范围 本标准规定了高效液相色谱法 （ ＨＰＬＣ ） 测定配合饲料和浓缩饲料中液态蛋氨酸羟基类似物及配合 饲料 、 浓缩饲料和添加剂预混合饲料中羟基蛋氨酸钙的方法 。 本标准适用于配合饲料和浓缩饲料中液态蛋氨酸羟基类似物的测定 ， 也适用于配合饲料 、 浓缩饲料 和添加剂预混合饲料中羟基蛋氨酸钙的测定 。 本标准最低定量限为 ０．０３％ 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 　 饲料 　 采样 ＧＢ ／ Ｔ１９３７１．１ — ２００３ 　 饲料添加剂 　 液态蛋氨酸羟基类似物 ３ 　 原理 用 １０％ 的乙腈水溶液提取样品中的蛋氨酸羟基类似物 ， 用氢氧化钾将蛋氨酸羟基类似物水解为有 活性的单体 ， 磷酸调节水解液的 ｐＨ 值 。 反相高效液相色谱分离 ， 紫外检测器 ２１４ｎｍ 处测定蛋氨酸羟 基类似物含量 。 由蛋氨酸羟基类似物含量可以换算出羟基蛋氨酸钙的含量 。 ４ 　 试剂 以下所用的试剂 ， 除特别注明外均为优级纯试剂 ， 水符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 一级用水的规定 。 ４ ． １ 　 乙腈 ： 色谱纯 。 ４ ． ２ 　 提取剂 ： １０％ 乙腈水溶液 。 ４ ． ３ 　 氢氧化钾溶液 ： ５０％ 。 ４ ． ４ 　 磷酸溶液 ： １＋１ （ 体积比 ）。 ４ ． ５ 　 ＨＰＬＣ 流动相 ： ５％ 乙腈水溶液 ， 每升加入 ０．５ｍＬ 三氟乙酸 。 ４ ． ６ 　 蛋氨酸羟基类似物标准样品 ： 除非购买标样 ， 否则需按 ＧＢ ／ Ｔ１９３７１．１ — ２００３ 准确测定含量 。 ５ 　 仪器设备 ５ ． １ 　 振荡器 ： 水平方向振荡 ， 频率 ２５０ｒ ／ ｍｉｎ ～ ３００ｒ ／ ｍｉｎ 。 ５ ． ２ 　 超声水浴 。 ５ ． ３ 　 ＨＰＬＣ 系统 ， 由下述部件组成 。 ５ ． ３ ． １ 　 紫外检测器 ， 适合在 ２１０ｎｍ 处测定 。 ５ ． ３ ． ２ 　 分析柱 ： 填有粒度为 ５ μ ｍ 键合硅胶的 Ｃ １８ 柱或性能相当的其他分析柱 。 柱温为室温 。 １ 犌犅 ／ 犜 １９３７１ ． ２ — ２００７ ６ 　 采样 ６ ． １ 　 采样步骤 按 ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 采集实验室样品 。 ６ ． ２ 　 试样的制备 将实验室样品粉碎 ， 全部通过 ０．４５ｍｍ 筛 ， 充分混匀 ， 贮于磨口瓶中备用 。 ７ 　 分析步骤 ７ ． １ 　 提取 称取适量制备好的试料 ２ｇ ～ ５ｇ （ 精确至 ０．０００１ｇ ）， 置于 １５０ｍＬ 具塞三角瓶中 ， 准确加入一定量 的提取液 ， 一般 ５０ｍＬ ～ １００ｍＬ ， 混合后置于振荡器上剧烈振荡 ３０ｍｉｎ 或置于超声水浴中提取 ３０ｍｉｎ ， 静置 １０ｍｉｎ ， 离心或过滤 ， 滤液备用 。 ７ ． ２ 　 水解 准确移取滤液 ５ｍＬ 于 １０ｍＬ 具塞试管中 ， 准确加入 ０．１ｍＬ 氢氧化钾溶液 （ ４．３ ）， 手摇至少 １０ｓ ， 准确加入 ０．２ｍＬ 磷酸溶液 （ ４．４ ）， 手摇至少 １０ｓ ， 水解液离心或过滤 ， 滤液过 ０．４５ μ ｍ 滤膜后备用 。 ７ ． ３ 　 标准溶液的制备 准确称取 ０．１１３６ｇ 液态蛋氨酸羟基类似物 （ ８８．００％ ） 标准样品 ， 用提取剂 （ ４．２ ） 定容至 １００ｍＬ ， 蛋 氨酸羟基类似物浓度为 １．００ｍｇ ／ ｍＬ 。 准确吸取 ２．５ 、 ５．０ 、 １０．０ 、 ２０．０ｍＬ 以上溶液至 ５０ｍＬ 容量瓶 ， 用提取剂 （ ４．２ ） 定容至刻度后摇匀 ， 此标准系列的浓度为 ０．０５ 、 ０．１０ 、 ０．２０ 、 ０．４０ 、 １．００ｍｇ ／ ｍＬ 。 用以上标准系列与试样提取液同时做水解 ， 测定 。 ７ ． ４ 　 犎犘犔犆 测定 ７ ． ４ ． １ 　 色谱条件 流速 ： １．０ｍＬ ／ ｍｉｎ 。 检测波长 ： ２１０ｎｍ 。 进样量 ： ２０ μ Ｌ ～ ５０ μ Ｌ 。 ７ ． ４ ． ２ 　 测定 向 ＨＰＬＣ 分析仪连续注入蛋氨酸羟基类似物标准溶液 ， 直至得到基线平稳 、 峰形对称且峰面积能 够重现的色谱峰 。 依次注入标准及试样水解液 ， 积分得到峰面积 ， 用标准系列进行单点或多点校准 。 ８ 　 结果计算 试样中蛋氨酸羟基类似物的含量 犡 １ 以质量分数 （ ％ ） 表示 ， 按式 （ １ ） 计算 ： 犡 １ ＝ 犮 × 犞 犿 × １０００ × １００ …………………………（ １ ） 　　 试样中羟基蛋氨酸钙的含量 犡 ２ 以质量分数 （ ％ ） 表示 ， 按式 （ ２ ） 计算 ： 犡 ２ ＝ 犮 × 犞 犿 × １０００ × ３３８ ． ４ ３００ ． ４ × １００ …………………………（ ２ ） 　　 式中 ： 犮 ——— 由标准曲线查得的试样测定液中蛋氨酸羟基类似物的浓度 ， 单位为毫克每毫升 （ ｍｇ ／ ｍＬ ）； 犞 ——— 加到试样中的提取液体积 ， 单位为毫升 （ ｍＬ ）； 犿 ——— 试样质量 ， 单位为克 （ ｇ ）； ３３８．４ ——— 羟基蛋氨酸钙的分子质量 ； ２ 犌犅 ／ 犜 １９３７１ ． ２ — ２００７ ３００．４ ——— 羟基蛋氨酸的分子质量 。 平行测定结果用算术平均值表示 ， 结果表示至小数点后两位 。 ９ 　 允许差 当含量小于 ０．５％ 时 ， 两个平行试料测定值相差不大于 ０．０５％ ； 当含量大于或等于 ０．５％ 时 ， 两个 平行试料测定值的相对偏差不大于 ５％ 。 犌犅 ／ 犜 １９３７１ ． ２ — ２００７