书 书 书犐犆犛 １１ ． ２２０ 犅 ４１ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 １９１８０ — ２０２０ /G21 /G22 ＧＢ ／ Ｔ１９１８０ — ２００３ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A 犇犻犪犵狀狅狊狋犻犮狋犲犮犺狀犻狇狌犲狊犳狅狉犫狅狏犻狀犲狊狆狅狀犵犻犳狅狉犿犲狀犮犲狆犺犪犾狅狆犪狋犺狔 ２０２０  １２  １４ /G2B /G2C ２０２０  １２  １４ /G2D /G2E /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G2B /G2C书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准代替 ＧＢ ／ Ｔ１９１８０ — ２００３ 《 牛海绵状脑病诊断技术 》。 本标准与 ＧＢ ／ Ｔ１９１８０ — ２００３ 相比 ， 除编辑性修改外 ， 主要技术变化如下 ： ——— 增补了 Ｈ · Ｅ 组织病理染色法 、 免疫组织化学方法和免疫印迹方法的适用范围 ， 删除了 “ 也可用于其他动物的传染性海绵状脑病的诊断 ”（ 见第 １ 章 ）； ——— 优化了临床症状的描述 （ 见 ４．３ ）； ——— 优化了 Ｈ · Ｅ 组织病理染色法操作步骤 （ 见 ５．１ ） 和免疫组织化学方法操作步骤 （ 见 ５．２ ）； ——— 增补了免疫印迹方法 （ 见 ５．３ ）。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出 。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ１８１ ） 归口 。 本标准起草单位 ： 中国动物卫生与流行病学中心 。 本标准主要起草人 ： 王志亮 、 刘雨田 、 孙成友 、 迟田英 、 宋芳芳 、 邹艳丽 、 于小静 、 吴晓东 、 王树双 。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为 ： ——— ＧＢ ／ Ｔ１９１８０ — ２００３ 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 １９１８０ — ２０２０ 引 　　 言 　　 牛海绵状脑病 （ ＢｏｖｉｎｅＳｐｏｎｇｉｆｏｒｍＥｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ ， ＢＳＥ ） 是由朊病毒引起的牛的一种慢性致死性神经性疾病 ， 对动物和人构成较大危害 。 世界动物卫生组织 （ ＯＩＥ ） 将其列为严重影响国际贸易的动物疫病之一 ， 我国将其归为一类动物疫病 。 我国现行 《 牛海绵状脑病诊断技术 》（ ＧＢ ／ Ｔ１９１８０ — ２００３ ） 系 ２００３ 年 ６ 月 ４ 日由原国家质量监督检验检疫总局发布 ， ２００３ 年 １２ 月 １ 日起实施 。 该标准仅包括临床症状 、 组织病理学 、 免疫组织化学等三种诊断方法 ， 未包括 ＯＩＥ 陆生动物手册指定的另一种确诊方法即免疫印迹 。 免疫印迹方法比免疫组织化学方法更灵敏 ， 特异性更好 。 因此 ， 免疫印迹方法是牛海绵状脑病诊断技术中一种更好的确诊方法 ， 它能更好地服务于我国疯牛病的监测工作 。 ＢＳＥ 分为典型 ＢＳＥ 和非典型 ＢＳＥ 。 典型 ＢＳＥ 是由于牛采食污染牛羊朊病毒的肉骨粉或者饲料而引起 ， 非典型 ＢＳＥ 为自然发生的一种散发性 ＢＳＥ 。 自然条件下 ， ＢＳＥ 经由消化道传播 ， 未发现水平和垂直传播的证据 。 典型 ＢＳＥ 的潜伏期一般为 ２ 年 ～ ８ 年 ， 平均为 ４ 年 ～ ５ 年 ， 多发于 ４ ～ ６ 岁的牛 ， ２ 岁以下罕见 ， ６ 岁以上明显减少 。 根据病原的分子量大小 ， 非典型 ＢＳＥ 又分为 Ｈ 型和 Ｌ 型 。 非典型 ＢＳＥ 的平均发病年龄为 １１ 岁 。 ＢＳＥ 病程多为数月至一年 ， 最终死亡 。 大多数 ＢＳＥ 病牛无典型临床症状 ， 因此 ＢＳＥ 的诊断应通过实验室检测来实现 。 ＢＳＥ 的病原是动物机体内朊蛋白的异构体 ， 在病牛血清里检测不到 ＢＳＥ 朊病毒抗体 ， 所以血清学检测方法对于 ＢＳＥ 来说是无意义的 。 目前 ， 实验室诊断方法多以检测 ＢＳＥ 病原为目的 ， 包括免疫组织化学方法 、 免疫印迹方法 、 ＥＬＩＳＡ 方法等 ， 其中免疫组织化学方法和免疫印迹方法是 ＯＩＥ 手册规定的 ＢＳＥ 确诊方法 。 ＢＳＥ 病牛的中枢神经被朊病毒侵害会出现海绵状空泡变性 ， 在中枢神经保存良好且未发生自溶的情况下 ， 应用 Ｈ · Ｅ 组织病理染色法可以观察到这些病变情况 。 ＯＩＥ 手册规定 Ｈ · Ｅ 组织病理染色法是确诊 ＢＳＥ 的辅助方法 ， 在使用免疫组织化学方法诊断 ＢＳＥ 时应同时使用 Ｈ · Ｅ 组织病理染色法予以辅助确诊 ； 在使用免疫印迹方法诊断 ＢＳＥ 时 ， 如果样品适合进行 Ｈ · Ｅ 组织病理染色 ， 那么也应同时使用 Ｈ · Ｅ 组织病理染色法予以辅助确诊 。 Ⅱ 犌犅 ／ 犜 １９１８０ — ２０２０ 牛海绵状脑病诊断技术 １ 　 范围 本标准规定了 ＢＳＥ 诊断的临床诊断 、 实验室诊断及综合判定技术要求 。 本标准适用于 ＢＳＥ 的诊断 ， 其中临床诊断适用于 ＢＳＥ 的监测和流行病学调查 ， Ｈ · Ｅ 组织病理染色法适用于 ＢＳＥ 中枢神经系统的病理诊断 ， 免疫组织化学方法和免疫印迹方法适用于 ＢＳＥ 的病原学诊断 。 ２ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ＢＳＥ ： 牛海绵状脑病 （ ＢｏｖｉｎｅＳｐｏｎｇｉｆｏｒｍＥｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ ） Ｈ · Ｅ ： 苏木精伊红 （ Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎａｎｄｅｏｓｉｎ ） ＨＲＰ ： 辣根过氧化物酶 （ Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ） ＰＢＳ ： 磷酸盐缓冲溶液 （ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓｏｌｕｔｉｏｎ ） ＰＫ 酶 ： 蛋白酶 Ｋ （ ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ ） ＰＶＤＦ ： 聚偏氟乙烯 （ Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅｆｌｕｏｒｉｄｅ ） ＳＤＳ ： 十二烷基硫酸钠 （ Ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ ） ＴＢＳＴ ： 等渗缓冲盐溶液 （ ＴｒｉｓＨＣｌｂｕｆｆｅｒｅｄｓｏｌｕｔｉｏｎｗｉｔｈＴｗｅｅｎ ） ３ 　 临床诊断 ３ ． １ 　 易感动物 牛科和猫科动物 ， 包括各种牛 、 各种羊和各种猫科动物 。 ３ ． ２ 　 临床症状 ３ ． ２ ． １ 　 行为异常 　 表现为不安 、 恐惧 、 异常震惊或沉郁 ； 不自主运动 ， 如磨牙 、 震颤 ； 不愿经过有缝隙的地面或进入畜栏等 。 ３ ． ２ ． ２ 　 感觉或反应过敏 表现为视 、 听 、 触三觉过于敏感 。 对光线的明暗变化 、 外部声响以及颈部触摸过度敏感 ， 这是 ＢＳＥ 病牛的特征性临床表现 。 ３ ． ２ ． ３ 　 运动异常 病牛步态呈 “ 鹅步 ” 状 ， 共济失调 ， 四肢伸展过度 ， 有时倒地 ， 难以站立 。 ３ ． ２ ． ４ 　 体重和体况下降 病牛的体重和体况下降 ， 表现出异常消瘦 ， 体质虚弱 。 １ 犌犅 ／ 犜 １９１８０ — ２０２０ ３ ． ３ 　 病理变化 剖检无明显病变 。 ３ ． ４ 　 结果判定 易感动物出现上述临床症状 ， 又不能确定为其他疾病时 ， 可判定为疑似 ＢＳＥ 。 确诊应采集易感动物的脑组织进行实验室诊断 。 ４ 　 实验室诊断 ４ ． １ 　 犎 · 犈 组织病理染色法 ４ ． １ ． １ 　 实验室生物安全要求 实验操作应在生物安全 Ⅱ 级以上的实验室进行 。 涉及有毒挥发性试剂的操作应在通风橱中进行 ， 如甲醛 、 甲酸 、 二甲苯 、 氯仿等 。 ４ ． １ ． ２ 　 仪器设备 显微镜 、 切片机 、 电锯 ／ 钢锯 、 骨钳 、 眼科剪 、 直形镊 （ 长约 ２５ｃｍ ）、 手术刀 、 切片刀 、 烘烤箱 、 脱水筐 、 染色缸 、 包埋模具 、 载玻片 、 盖玻片 、 玻璃棒 、 染色架 、 量筒 （ 量程分别为 １００ｍＬ 、 １０００ｍＬ 、 ５０００ｍＬ ）、 通风橱 。 ４ ． １ ． ３ 　 试剂 ４ ． １ ． ３ ． １ 　 蒸馏水 。 ４ ． １ ． ３ ． ２ 　 １０％ 中性福尔马林固定液 （ 见附录 Ａ 中 Ａ．１ ）。 ４ ． １ ． ３ ． ３ 　 无水乙醇 。 ４ ． １ ． ３ ． ４ 　 二甲苯 。 ４ ． １ ． ３ ． ５ 　 氯仿 。 ４ ． １ ． ３ ． ６ 　 软蜡 （ 熔点 ５６℃ ）。 ４ ． １ ． ３ ． ７ 　 硬蜡 （ 熔点 ６０℃ ）。 ４ ． １ ． ３ ． ８ 　 苏木素染液 （ Ｈ · Ｅ 染液 ， 见 Ａ．２ ）。 ４ ． １ ． ３ ． ９ 　 １％ 盐酸酒精 （ 见 Ａ．３ ）。 ４ ． １ ． ３ ． １０ 　 饱和碳酸锂水溶液 （ 见 Ａ．４ ）。 ４ ． １ ． ３ ． １１ 　 ９５％ 酒精伊红溶液 （ 见 Ａ．５ ）。 ４ ． １ ． ３ ． １２ 　 中性树胶 。 ４ ． １ ． ３ ． １３ 　 无机试剂原料均为分析纯 。 ４ ． １ ． ４ 　 采样 将牛头固定 ， 用电锯从前额两牛角根部向枕骨大孔背侧缘方向锯开 ， 使脑部暴露 。 剪开脑膜并切断所有与脑部相连的神经和血管 ， 取出整脑 ， 包括大脑 、 小脑和完整脑干 。 大规模监测采样时 ， 可用专用采样勺 （ 国家牛海绵状脑病参考实验室提供 ） 从枕骨大孔处取出延脑部组织即可 。 采样勺取样时 ，