ICS65.150 B52 中华人民共和国国家标准 GB/T19163—2010 代替GB19163—2003 牛 蛙 Bullfrog 2011-01-10发布 2011-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准代替GB19163—2003《牛蛙》。 本标准与GB19163—2003相比主要变化如下: ———标准性质改为推荐性; ———增加了牛蛙年龄鉴定方法; ———增加了引用标准GB/T18654.1、GB/T18654.2、GB/T18654.12、GB/T25884; ———删除了原标准的附录A。 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会淡水养殖分技术委员会归口。 本标准起草单位:湖南农业大学、湖南生物机电学院。 本标准主要起草人:王晓清、王宇、肖克宇、何湘蓉、詹炜。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为: ———GB19163—2003。 ⅠGB/T19163—2010 牛 蛙 1 范围 本标准确立了牛蛙(RanacatesbeianaShaw)的名称与分类、主要形态构造特征、生长与繁殖、遗传 学特性、检测方法及结果判断。 本标准适用于牛蛙的种质检测与鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 GB/T18654.1 养殖鱼类种质检验 第1部分:检验规则 GB/T18654.2 养殖鱼类种质检验 第2部分:抽样方法 GB/T18654.12 养殖鱼类种质检验 第12部分:染色体组型分析 GB/T25884 蛙类形态性状测定 3 术语和定义 GB/T25884确立的术语和定义适用于本标准。 4 名称与分类 4.1 学名 牛蛙(RanacatesbeianaShaw)。 4.2 分类地位 无尾目(Anura)、蛙科(Ranidae)、蛙属(Rana)。 5 主要形态构造特征 5.1 外部形态特征 5.1.1 外形 身体粗短,头部宽而扁,略呈三角形,1对圆形鼓膜位于眼后方,鼓膜颜色与头部背面颜色基本一 致,沿眼后到鼓膜上方有明显的皮肤褶。皮肤较光滑,背部略显粗糙,有极微细的肤棱。前肢4指,无 蹼,指序为Ⅱ、Ⅰ、Ⅳ、Ⅲ,雄蛙第一指内侧有发达的婚垫,生殖季节显著增大,雌蛙没有婚垫;后肢特别发 达,5趾,全蹼,蹼不完全达趾端,趾序为Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅲ、Ⅳ。 体色随栖息环境、年龄、性别、营养状况而异。通常头部为绿色,背部为绿褐色、黄褐色或黑褐色,有 深浅不一的不规则状斑块或斑纹,腹部为灰白色,有暗灰色斑纹。成熟雄蛙下颌部为金黄色,雌蛙则与 腹部颜色一致。 牛蛙外部形态见图1。 1GB/T19163—2010 图1 牛蛙外形(♂) 5.1.2 可量性状 对于体长10.3cm~16.1cm,体重175.2g~548.7g的牛蛙,实测性状比例值见表1。 表1 实测可量性状比例值 性别体长/头长 头宽/头长 鼓膜径/眼径 后肢长/体长 足长/前臂长Ⅳ趾长/ Ⅳ-Ⅴ趾蹼宽 ♀3.093±0.2471.162±0.0960.942±0.0981.467±0.0781.609±0.1191.770±0.242 ♂2.981±0.2431.168±0.0891.338±0.1541.475±0.1021.613±0.1151.708±0.244 5.2 内部构造特征 5.2.1 声囊 雄蛙咽部有1对内声囊,开口于口咽腔;雌蛙无声囊。 5.2.2 脊椎 颈椎骨1枚、躯椎骨7枚、荐椎骨1枚、尾杆骨1枚。属前凹后凸的参差型椎体。 5.2.3 生殖系统 成熟雄体有一对浅黄色卵圆形的精巢,保留有退化状态的缪勒氏管。成熟雌体有一对囊状结构的 卵巢,卵巢内含有淡黄色的早期卵和动物极为黑色、植物极为乳白色的成熟卵或接近成熟卵。 生殖腺的前方各有一个指状脂肪体,性成熟前为白色或淡黄色,性成熟后为黄色,大小随季节及营 养状况等因素变化。 6 生长与繁殖 6.1 生长 养殖条件下牛蛙体长、体重的实测值见表2。 表2 养殖条件下牛蛙的体长、体重实测值 体长/cm4.63± 0.317.21± 0.4310.20± 0.4712.24± 0.2813.47± 0.3914.33± 0.2914.96± 0.3515.58± 0.4216.15± 0.52 体重/g11.09± 0.8042.43± 4.61115.73± 15.02202.40± 17.56294.45± 17.77373.82± 21.15441.32± 28.26500.84± 34.13546.55± 38.97 2GB/T19163—2010 6.2 繁殖 6.2.1 性成熟年龄 性成熟年龄为2龄。 6.2.2 产卵季节 北方地区为5月份~8月份,湖南、湖北等省为4月份~9月份,广东、福建等省为3月份~11月 份,适宜产卵水温20℃~30℃。 6.2.3 产卵次数与类型 性成熟雌蛙每年可产卵1次~2次,并以春季产卵为主。卵球形,卵径1.2mm~1.5mm,动物极 深黑色,植物极乳白色,产出的卵外包胶质膜,相互粘连成单层或团状卵块。 6.2.4 怀卵量 性成熟雌蛙生殖季节卵巢系数为12.6%~27.6%,绝对怀卵量(5.0±0.77)×104粒,相对怀卵量 (106.7±8.69)粒/g。 7 遗传学特性 7.1 细胞遗传学特性 牛蛙体细胞染色体数:2n=26,臂数(NF):52,核型公式:2n=22m+4sm。 牛蛙染色体组型见图2。 图2 牛蛙染色体组型图 7.2 生化遗传学特性 牛蛙心肌的乳酸脱氢酶(LDH)同工酶电泳酶谱见图3,酶带扫描图见图4。 图3 牛蛙心肌LDH同工酶电泳酶谱 图4 牛蛙心肌LDH同工酶酶带扫描图 8 检测方法 8.1 抽样 按GB/T18654.2的规定执行。 3GB/T19163—2010 8.2 年龄鉴定 8.2.1 取样 剪取牛蛙第2趾骨,清洗晾干。 8.2.2 操作步骤 将材料放入80%乙醇中硬化10h~15h,在3%硝酸溶液中脱钙24h左右,使其软化,然后按常规 石蜡切片方法制片。 8.2.3 观察年龄 在显微镜(10×20)下可观察到黑色狭窄带与淡红色宽带间隔的排列,黑色带即为年轮标志,1个年 轮记为1龄,2个年轮记为2龄,依此类推。 8.3 生物学性状测定 按GB/T25884的规定执行。 8.4 繁殖力的测定 在繁殖季节,解剖未产卵的雌亲蛙,取出卵巢,用电子秤称重,再称取1.0g卵,2个样品,分别计数 每克卵的平均卵粒数。卵巢中所含的全部卵粒数即为绝对怀卵量,单位体重(g)所含的卵粒数为相对 怀卵量。 8.5 染色体的测定 8.5.1 标本制备 术前8h~12h腹腔注射质量分数为0.1%的植物血凝聚素(PHA)0.5mL~1.0mL(每100g体 重),术前4h~6h腹腔注射秋水仙素溶液(每克体重10μg~15μg);解剖牛蛙,从股骨和胫骨中取骨 髓放入质量分数为0.4%的氯化钾(KCl)溶液中,37℃水浴15min~20min。以1000r/min离心 10min,弃其上清液,加1mL固定液(甲醇∶冰乙酸为3∶1),4℃条件下固定20min,重复固定2次。 再加少量固定液,制取细胞悬液;取细胞悬液滴片,在酒精灯上文火烘干,浸没在吉姆萨(Giemsa)工作 液(配制按GB/T18654.12的规定执行)中染色30min,用蒸馏水冲去多余染液,空气干燥制片。 8.5.2 染色体计数和组型分析 按GB/T18654.12的规定执行。 8.6 生化遗传分析 8.6.1 试样的制备与保存 解剖牛蛙,取心肌,用生理盐水洗去血液后称重、切碎,按质量体积比1∶5加生理盐水低温匀浆, 4℃条件下以12000r/min离心10min。取上清液加入等量40%的蔗糖溶液,摇匀后作好标记置于 -25℃冰箱中保存。 8.6.2 电泳分离 用水平平板电泳仪及质量分数为6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,用溴酚蓝作指示剂。加样前, 50mA预电泳30min;加样后,稳压280V,电泳80min~90min,至溴酚蓝到达距胶前沿1cm处停止。 8.6.3 染色固定 电泳结束后,取凝胶放入预先配好的染色液中,37℃温浴10min~30min,至条带清晰,倾出染色 液,用固定液(按甲醇∶乙酸∶水的体积比为45∶12∶43配制)终止反应。 同工酶染色液配制见附录A。 8.6.4 扫描测定 用激光扫描仪对电泳图谱进行扫描分析。 9 结果判断 按GB/T18654.1的规定执行。 4GB/T19163—2010 附 录 A (规范性附录) 同工酶染色液的配制 A.1 磷酸盐缓冲液(0.5mol/L)的配制 取磷酸二氢钾(KH2PO4)6.8g溶于约80mL蒸馏水中,以氢氧化钠(NaOH)溶液(2mol/L)调节 pH至7.4,再用蒸馏水定容至100mL。 A.2 氯化硝基四氮唑蓝(NBT)贮液(mg/mL)的配制 取50mg氯化硝基四氮唑蓝(NBT)定容于50mL蒸馏水中,4℃保存。 A.3 辅酶Ⅰ(NAD)贮液(mg/mL)的配制 取100mg辅酶Ⅰ(NAD)定容于10mL蒸馏水中。 A.4 吩嗪甲酯硫酸盐(PMS)贮液(mg/mL)的配制 取50mg吩嗪甲酯硫酸盐(PMS)定容于50mL蒸馏水中,4℃暗处保存。 A.5 氯化钠(NaCl)溶液(0.