书 书 书犐犆犛 １１ ． ２２０ 犅 ４１ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 １８０８９ — ２００８ 代替 ＧＢ ／ Ｔ１８０８９ — ２０００ 蓝舌病病毒分离 、 鉴定及血清中和 抗体检测技术 犐狊狅犾犪狋犻狅狀 ， 犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀犪狀犱狊犲狉狌犿狀犲狌狋狉犪犾犻狕犪狋犻狅狀犪狀狋犻犫狅犱狔 狋犲狊狋犻狀犅犾狌犲狋狅狀犵狌犲狏犻狉狌狊 ２００８  １２  ３１ 发布 ２００９  ０５  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准代替 ＧＢ ／ Ｔ１８０８９ — ２０００ 《 蓝舌病微量血清中和试验及病毒分离和鉴定方法 》。 本标准与 ＧＢ ／ Ｔ１８０８９ — ２０００ 相比主要变化如下 ： ——— 对标准名称进行了修改 ； ——— 删除了蓝舌病病毒鉴定中的病毒中和试验部分 ； ——— 增加了病毒鉴定中 ＲＴＰＣＲ 方法的鉴定 。 本标准的附录 Ａ 为规范性附录 。 本标准由中华人民共和国农业部提出 。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口 。 本标准起草单位 ： 中华人民共和国云南出入境检验检疫局 、 中华人民共和国深圳出入境检验检 疫局 。 本标准主要起草人 ： 周晓黎 、 杨建明 、 艾军 、 花群义 、 杨晓花 、 张其艳 、 严树发 、 董俊 、 叶玲玲 、 徐维加 。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为 ： ——— ＧＢ ／ Ｔ１８０８９ — ２０００ 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 １８０８９ — ２００８ 蓝舌病病毒分离 、 鉴定及血清中和 抗体检测技术 １ 　 范围 本标准规定了蓝舌病病毒分离 、 鉴定及血清中和抗体检测的技术 。 本标准适用于蓝舌病病毒的分离 、 鉴定及动物感染蓝舌病病毒后血清中和抗体的检测 。 ２ 　 符号和缩略语 下列符号和缩略语适用于本标准 。 ＢＨＫ ２１ ——— 幼仓鼠肾细胞株 ； ＢＬＰ ——— 乳糖蛋白胨缓冲肉汤 ； ＢＴ ——— 蓝舌病 ； ｂｐ ——— 碱基对 ； ＣＰＥ ——— 致细胞病变作用 ； Ｃ６ ／ ３６ ——— 蚊子细胞株 ； ＤＥＰＣ ——— 焦碳酸二乙酯 ； ＳＰＦ ——— 无特定病原体 ； ＴＣＩＤ ５０ ——— 半数组织培养感染量 ； Ｖｅｒｏ ——— 非洲绿猴肾细胞株 。 ３ 　 蓝舌病病毒分离 ３ ． １ 　 材料 １０ 日龄 ～ １１ 日龄 ＳＰＦ 鸡胚 。 ３ ． ２ 　 设备与器材 鸡胚开孔器 、 照蛋灯或照蛋箱 、 乳钵或组织捣碎器 、 倒置显微镜 。 ３ ． ３ 　 试验程序 ３ ． ３ ． １ 　 样品 肝素抗凝血 （ 每 ５ｍＬ 血液用 １０ＩＵ 肝素 ）、 脏器 （ 脾 、 肝 、 肾 、 淋巴结 ）、 精液 、 库蠓 。 用于病毒分离的 样品应置冷藏容器中保存 ， 在 ２４ｈ 内送到实验室 ， 并立即进行处理 。 ３ ． ３ ． ２ 　 血液样品制备 取肝素抗凝血 ５ｍＬ ， 用磷酸盐缓冲液 （ ＰＢＳ ， 配方见附录 Ａ ） 洗涤血样 ３ 次 ～ ４ 次 ， 每次 ２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ ， 弃上清液后加入倍量 ＢＬＰ （ 配方见附录 Ａ ）， 置冰浴中用超声波处理 （ ４０ μ Ａ 、 １ｍｉｎ ）。 经处 理的样品当天使用 ， 使用前置 ４℃ 保存 ， 剩余样品置 －７０℃ 保存备用 。 ３ ． ３ ． ３ 　 组织样品制备 无菌采集动物脾 、 淋巴结 、 肝 、 肾各 ５ｇ ， 剪碎后加入 ＢＬＰ１０ｍＬ （ 含青霉素 ２０００ＩＵ ／ ｍＬ 、 链霉素 ２０００ μ ｇ ／ ｍＬ ）， 置乳钵中研磨 ， ４℃ 冰箱中浸提 ４ｈ ， 取上清液 ５ｍＬ 用超声波裂解处理 （ １００ μ Ａ 、 １ｍｉｎ ～ ２ｍｉｎ ） 或冻融三次 ， ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ２０ｍｉｎ ， 取上清液使用 ， 使用前置 ４℃ 保存 ， 剩余样品置 －７０℃ 保 存备用 。 ３ ． ３ ． ４ 　 精液样品制备 取精液样品 ０．５ｍＬ ， 用 ＢＬＰ 作 １∶５ 稀释后 ， ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ２０ｍｉｎ ， 弃上清液 ， 再用 ＢＬＰ 作 １ 犌犅 ／ 犜 １８０８９ — ２００８ １∶５ 稀释 ， 充分混匀 ， 置冰浴中用超声波处理 （ １００ μ Ａ 、 １ｍｉｎ ～ ２ｍｉｎ ） 或冻融三次 ， ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ２０ｍｉｎ ， 取上清液使用 ， 使用前置 ４℃ 保存 ， 剩余样品置 －７０℃ 保存备用 。 ３ ． ３ ． ５ 　 库蠓样品制备 取 ２００ 个 ～ ３００ 个库蠓盛于小试管中 ， 加入含青霉素 ２０００ＩＵ ／ ｍＬ 、 链霉素 ２０００ μ ｇ ／ ｍＬ 的 ＢＬＰ３ｍＬ ～ ５ｍＬ ， 置冰浴中研磨虫体 ， ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ２０ｍｉｎ ， 取上清液使用 ， 使用前置 ４℃ 保存 ， 剩余样品置 －７０℃ 保存备用 。 ３ ． ３ ． ６ 　 鸡胚静脉接种 ３ ． ３ ． ６ ． １ 　 选择 １０ 日龄 ～ １１ 日龄发育良好的 ＳＰＦ 鸡胚 ， 在照蛋灯上标记静脉位置和开孔区 ， 用开孔器 开窗备用 。 ３ ． ３ ． ６ ． ２ 　 在无菌条件下 ， 每份样品接种 ５ 个鸡胚 ， 每个鸡胚静脉接种 ０．１ｍＬ ， 接种后用擦镜纸封口 ， 置 ３３．５℃ 培养 。 ３ ． ３ ． ６ ． ３ 　 逐日观察并记录 ， ２４ｈ 内死亡的鸡胚为非特异性死亡 ， 将 ４８ｈ 后死亡的鸡胚收置 ４℃ 冰箱保 存 ， 于接种后第 ６ 天同未死亡鸡胚一起收毒 。 ３ ． ３ ． ７ 　 收毒 在无菌条件下 ， 用碘酒 、 酒精棉球对鸡胚气室处进行消毒 ， 凿开蛋壳 ， 按常规方法剪破壳膜 、 尿囊膜 、 羊膜后 ， 取出胚体 ， 置平皿中 ， 在每个胚体上取若干组织块 （ 有病变时 ， 取病变组织 ）， 置组织捣碎器或乳 钵中研磨后 ， 按 １∶５ 加入 ＢＬＰ （ 含青霉素 ２０００ＩＵ ／ ｍＬ 、 链霉素 ２０００ μ ｇ ／ ｍＬ ）， 置 ４℃ 冰箱浸提 ４ｈ ， 当 日使用 ， 剩余样品置 －７０℃ 保存备用 。 ３ ． ３ ． ８ 　 接种敏感细胞 ３ ． ３ ． ８ ． １ 　 按常规方法在 １２ 孔细胞培养板上制备 Ｃ６ ／ ３６ 细胞单层 。 ３ ． ３ ． ８ ． ２ 　 将收获的鸡胚上清液 ， 接种细胞单层 ， 每份病料接种两孔 ， 每孔接种 ０．１ｍＬ ， 置 ２５℃ 培养 ， 第 ２ 天换液后 ， 培养 ７ｄ 。 ３ ． ３ ． ８ ． ３ 　 按常规方法在 １２ 孔细胞培养板上制备 ＢＨＫ ２１ 或 Ｖｅｒｏ 细胞单层 。 ３ ． ３ ． ８ ． ４ 　 第 ７ 天用吸管吹下被接种的 Ｃ６ ／ ３６ 细胞 。 ３ ． ３ ． ８ ． ５ 　 将吹下的 Ｃ６ ／ ３６ 细胞悬液接种于 ＢＨＫ ２１ 或 Ｖｅｒｏ 细胞单层 ， ３７℃ 吸附 １ｈ 后 ， 加入维持液置 ３７℃ 培养 。 ２４ｈ 后逐日观察细胞病变 ， 连续观察 ７ｄ 。 如盲传两代出现细胞病变 ， 则应进行荧光抗体 、 ＰＣＲ 试验进行鉴定 ； 如无细胞病变 ， 则判定为病毒分离阴性 。 ４ 　 蓝舌病病毒鉴定 ４ ． １ 　 荧光抗体试验 （ 直接法 ） ４ ． １ ． １ 　 材料 荧光标记的蓝舌病病毒单克隆抗体 。 ４ ． １ ． ２ 　 设备与器材 倒置荧光显微镜 、 ９６ 孔细胞培养板 。 ４ ． １ ． ３ 　 试验程序 ４ ． １ ． ３ ． １ 　 将接种的 ＢＨＫ ２１ 或 Ｖｅｒｏ 细胞培养物冻融一次 ， １０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ ， 取上清液接种于带 有玻片的 ２４ 孔组织培养板的 ＢＨＫ ２１ 或 Ｖｅｒｏ 细胞单层 。 每份样品接种两孔 ， 同时设阳性 、 阴性对照 ， ３７℃ 吸附 １ｈ 后加入维持液 ， 置 ３７℃ 培养 ７２ｈ 。 ４ ． １ ． ３ ． ２ 　 取出培养板中的玻片 ， 用 ０．０１ｍｏｌ ／ ＬＰＢＳ 漂洗一次 ， 预冷丙酮固定 １５ｍｉｎ 。 ４ ． １ ． ３ ． ３ 　 每片滴加荧光标记的蓝舌病病毒单克隆抗体 ， 使其覆盖于玻片 ， 置暗湿盒中于 ３７℃ 作用 ３０ｍｉｎ 。 ４ ． １ ． ３ ． ４ 　 用 ０．０１ｍｏｌ ／ ＬＰＢＳ 洗片三次 ， 再用蒸馏水洗片一次 。 ４ ． １ ． ３ ． ５ 　 风干 ， 用碳酸缓冲甘油 （ 配方见附录 Ａ ） 封片 ， 荧光显微镜检查 。 ２ 犌犅 ／ 犜 １８０８９ — ２００８ ４ ． １ ． ３ ． ６ 　 结果判定 ： 阳性对照的细胞浆内呈现颗粒状的黄绿色荧光 ， 阴性对照应无荧光或无特异性荧 光时 ， 被检病毒接种细胞的细胞浆内发现颗粒状的黄绿色荧光者即可判为阳性 。 ４ ． ２ 　 聚合酶链反应 （ 犚犜犘犆犚 ） ４ ． ２ ． １ 　 试剂和材料 ４ ． ２ ． １ ． １ 　 引物 （ ２５ｐｍｏｌ ／ μ Ｌ ）： 扩增 ＮＳ１ 蛋白编码基因 ＲＮＡ６ 保守序列 ， 其引物序列和在 ＲＮＡ６ 基因 中的位置如表 １ 所示 。 表 １ 编 　 号 引 　　 物 在 ＲＮＡ６ 中的位置 １ ５′ＧＴＴＣＴＣＴＡＧＴＴＧＧＣＡＡＣＣＡＣＣ３′ １０ ～ ３０ ２ ５′ＡＡＧＣＣＡＧＡＣＴＧＴＴＴＣＣＣＧＡＴ３′ ２８３ ～ ２６４ ３ ５′ＧＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧＡＧＡＧＡＧＣＧＡ３′ １７０ ～ １８９ ４ ５′ＣＣＣＧＡＴＣＡＴＡＣＡＴＴＧＣＴ