书 书 书犐犆犛 １１ ． ２２０ 犅 ４１ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 １７９９９ ． ６ — ２００８ 代替 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９．５ — １９９９ 犛犘犉 鸡 　 微生物学监测 第 ６ 部分 ： 犛犘犉 鸡 　 酶联免疫吸附试验 犛犘犉犮犺犻犮犽犲狀 — 犕犻犮狉狅犫犻狅犾狅犵犻犮犪犾狊狌狉狏犲犻犾犾犪狀犮犲 — 犘犪狉狋 ６ ： 犈狀狕狔犿犲犾犻狀犽犲犱犻犿犿狌狀狅狊狅狉犫犲狀狋犪狊狊犪狔犳狅狉犛犘犉犮犺犻犮犽犲狀 ２００８  １２  ３１ 发布 ２００９  ０５  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书中华人民共和国 国家标准 犛犘犉 鸡 　 微生物学监测 第 ６ 部分 ： 犛犘犉 鸡 　 酶联免疫吸附试验 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９．６ — ２００８  中国标准出版社出版发行 北京复兴门外三里河北街 １６ 号 邮政编码 ： １０００４５ 网址 ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ 电话 ： ６８５２３９４６ 　 ６８５１７５４８ 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 各地新华书店经销  开本 ８８０×１２３０１ ／ １６ 　 印张 ０．５ 　 字数 ９ 千字 ２００９ 年 ４ 月第一版 　 ２００９ 年 ４ 月第一次印刷  书号 ： １５５０６６ · １３６４９３ 如有印装差错 　 由本社发行中心调换 版权专有 　 侵权必究 举报电话 ：（ ０１０ ） ６８５３３５３３ 书 书 书前 　　 言 　　 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９ 《 ＳＰＦ 鸡 　 微生物学监测 》 分为 １０ 个部分 ： ——— 第 １ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 微生物学监测总则 ； ——— 第 ２ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 红细胞凝集抑制试验 ； ——— 第 ３ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 血清中和试验 ； ——— 第 ４ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 血清平板凝集试验 ； ——— 第 ５ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 琼脂扩散试验 ； ——— 第 ６ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 酶联免疫吸附试验 ； ——— 第 ７ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 胚敏感试验 ； ——— 第 ８ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 鸡白痢沙门氏菌检验 ； ——— 第 ９ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 试管凝集试验 ； ——— 第 １０ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 间接免疫荧光试验 。 本部分为 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９ 的第 ６ 部分 。 本部分修订参照了 ＧＢ ／ Ｔ１８９３６ — ２００３ 《 高致病性禽流感诊断技术 》、 ＧＢ ／ Ｔ１９１６７ — ２００３ 《 传染性囊 病诊断技术 》、 ＮＹ ／ Ｔ５３８ — ２００２ 《 鸡传染性鼻炎诊断技术 》、 ＯＩＥ 《 陆生动物 （ 哺乳动物 、 禽鸟和蜜蜂 ） 诊断 试验和疫苗手册 》（ 第五版 ） 中的有关规定 。 本部分代替 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９．５ — １９９９ 《 ＳＰＦ 鸡 　 酶联免疫吸附试验 》。 本部分与 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９．５ — １９９９ 相比主要变化如下 ： ——— 增加了间接酶联免疫吸附试验 ； ——— 增加了附录 Ａ “ 试剂的配制 ”。 本部分的附录 Ａ 为规范性附录 。 本部分由中华人民共和国农业部提出 。 本部分由全国动物防疫标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ１８１ ） 归口 。 本部分起草单位 ： 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 、 中国动物卫生与流行病学中心 、 济南斯帕法 斯家禽有限公司 。 本部分主要起草人 ： 曲连东 、 姜骞 、 韩凌霞 、 邵卫星 、 朱果 、 单忠芳 、 刘家森 、 司昌德 、 郭东春 、 于海波 、 孟庆文 。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为 ： ——— ＧＢ ／ Ｔ１７９９９．５ — １９９９ 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 １７９９９ ． ６ — ２００８ 犛犘犉 鸡 　 微生物学监测 第 ６ 部分 ： 犛犘犉 鸡 　 酶联免疫吸附试验 １ 　 范围 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９ 的本部分规定了酶联免疫吸附试验的技术要求 。 本部分间接酶联免疫吸附试验适用于对 ＳＰＦ 鸡进行以下病原微生物的血清抗体检测 ： 副鸡嗜血杆 菌 （ 犎犪犲犿狅狆犺犻犾狌狊 ）、 鸡毒支原体 （ 犕狔犮狅狆犾犪狊犿犪犵犪犾犾犻狊犲狆狋犻犮狌犿 ）、 滑液囊支原体 （ 犕狔犮狅狆犾犪狊犿犪狊狔狀狅狏犻犪犲 ）、 禽流感病毒 （ ＡｖｉａｎＩｎｆｌｕｅｚａＶｉｒｕｓ ）、 新城疫病毒 （ ＮｅｗｃａｓｔｌｅＤｉｓｅａｓｅＶｉｒｕｓ ）、 传染性支气管炎病毒 （ ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＢｒｏｎｃｈｉｔｉｓＶｉｒｕｓ ）、 传染性法氏囊病病毒 （ ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＢｕｒｓａｌＤｉｓｅａｓｅＶｉｒｕｓ ）、 网状内皮增生症 病毒 （ ＲｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓＶｉｒｕｓ ）、 鸡传染性贫血病毒 （ ＣｈｉｃｋｅｎＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＡｎａｅｍｉａＶｉｒｕｓ ）、 禽呼肠孤 病毒 （ 病毒性关节炎 ）（ ＡｖｉａｎＲｅｏｖｉｒｕｓ ）、 禽脑脊髓炎病毒 （ ＡｖｉａｎＥｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓＶｉｒｕｓ ）、 传染性喉气 管炎病毒 （ ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＬａｒｙｎｇｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓＶｉｒｕｓ ）、 禽腺病毒 Ⅲ 群 （ ＥＤＳ ）（ ＡｖｉａｎＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓＧｒｏｕｐ Ⅲ ）、 淋 巴细胞白血病病毒 （ ＬｙｍｐｈｏｉｄＬｅｕｋｏｓｉｓＶｉｒｕｓ ）。 本部分双抗体夹心酶联免疫吸附试验适用于对 ＳＰＦ 鸡进行淋巴细胞白血病病毒 Ｐ２７ 抗原检测 。 ２ 　 原理 间接酶联免疫吸附试验采用已知微生物抗原检测未知抗体 ， 双抗体夹心酶联免疫吸附试验采用已 知抗体检测未知抗原 。 ３ 　 间接酶联免疫吸附试验 ３ ． １ 　 试剂 ３ ． １ ． １ 　 包被抗原 ， 阴性 、 阳性对照血清 ， 羊抗鸡 ＬｇＧ 酶标抗体 ， 按说明书保存和使用 。 ３ ． １ ． ２ 　 包被液 、 稀释液 、 底物液 、 终止液配制方法见附录 Ａ 。 ３ ． ２ 　 器材 酶标板 ， 移液器 ， ３７℃ 恒温培养箱 ， 酶标仪 。 ３ ． ３ 　 操作程序 ３ ． ３ ． １ 　 抗原包被 ： 将禽流感病毒 、 传染性支气管炎病毒 、 传染性法氏囊病病毒 、 传染性喉气管炎病毒 、 新 城疫病毒 、 副鸡嗜血杆菌 、 禽腺病毒 Ⅲ 群 （ ＥＤＳ ）、 鸡毒支原体 、 滑液囊支原体 、 禽脑脊髓炎病毒 、 淋巴细胞 白血病病毒 、 网状内皮增生症病毒 、 禽呼肠孤病毒 （ 病毒性关节炎 ）、 鸡传染性贫血病毒抗原用包被液稀 释至工作浓度 ， 加入酶标板各孔中 ， 每孔 １００ μ Ｌ ， 置 ４℃ 冰箱过夜 。 ３ ． ３ ． ２ 　 洗涤 ： 甩净孔内抗原溶液 ， 用洗涤液加满各孔 ， 放置 ５ｍｉｎ ， 然后甩净 ， 如此重复 ３ 次 。 ３ ． ３ ． ３ 　 加被检血清 ： 用稀释液将被检血清以 １∶１００ 稀释 ， 每孔加入 １００ μ Ｌ ， 每次操作均设置阴性对照 孔两个 ， 阳性对照孔 、 空白对照孔各一个 ， 分别加入同样稀释的阴性血清 、 阳性血清和稀释液各 １００ μ Ｌ ， 加不同的血清样品时应换吸头 ， ３７℃ 温箱中作用 ３０ｍｉｎ 。 ３ ． ３ ． ４ 　 洗涤 ： 同 ３．３．２ 。 ３ ． ３ ． ５ 　 加羊抗鸡 ＩｇＧ 酶标抗体 ： 用稀释液将酶标抗体稀释至工作浓度 ， 每孔加入 １００ μ Ｌ ， ３７℃ 温箱中 作用 ３０ｍｉｎ 。 ３ ． ３ ． ６ 　 洗涤 ： 同 ３．３．２ 。 ３ ． ３ ． ７ 　 显色 ： 加入底物液 １００ μ Ｌ ， 室温避光反应 ５ｍｉｎ 左右 （ 至阴性对照孔开始产生颜色时 ）。 １ 犌犅 ／ 犜 １７９９９ ． ６ — ２００８ ３ ． ３ ． ８ 　 终止及读数 ： 每孔加 ５０ μ Ｌ 终止液终止显色 ， 然后用酶标仪读取每孔在 ４９０ｎｍ 处的吸光度 （ 犗犇 ） 值 。 ３ ． ４ 　 结果判定与表示方法 将样品的 犗犇 值代入式 （ １ ） 计算 。 犛 ／ 犖 ＝ 被检血清样品 犗犇 值 阴性对照平均 犗犇 值 ……………………………（ １ ） 　　 式中 ： 犛 ——— 被检血清样品 犗犇 值 ； 犖 ——— 阴性对照平均 犗犇 值 。 若 犛 ／ 犖 ≥ ２ 则结果判为阳性 ， 记为 “ ＋ ”， 否则判为阴性 ， 记为 “ － ”。 ４ 　 双抗体夹心酶联免疫吸附试验 ４ ． １ 　 试剂 ４ ． １ ． １ 　 包被抗体 （ 兔抗 Ｐ２７ＩｇＧ ）、 阳性抗原 （ Ｐ２７ ）、 阴性抗原 、 被检血清 、 被检蛋清 、 ＨＲＰ 兔抗 Ｐ２７ 、 羊 抗鸡 ＩｇＧ 酶标抗体按说明书保存和使用 。 ４ ． １ ． ２ 　 包被液 、 稀释液 、 底物液 、 终止液配制方法见附录 Ａ 。 ４ ． ２ 　 器材 见 ３．２ 。 ４ ． ３ 　 操作程序 ４ ． ３ ． １ 　 抗体包被 ： 用包被液将兔抗 Ｐ２７ＩｇＧ 作适当稀释 ， 每孔 １００ μ Ｌ ， ４℃ 过夜 。 ４ ． ３ ． ２ 　 洗涤 ： 甩去包被液 ， 每孔加满洗涤液 （ 约 ３００ μ Ｌ ）， 静置 ３ｍｉｎ ， 甩干 ， 如此重复 ３ 次 。 ４ ． ３ ． ３ 　 加样 ： 每孔加 １００ μ Ｌ 被检蛋清 ， 设阳性 、 阴性对照孔 ， 每个样品加两孔 ， ３７℃ 作用 ６０ｍｉｎ 甩去 样品 ， 洗涤同 ４．３．２ 。 ４ ． ３ ． ４ 　 每孔加 ＨＲＰ 兔抗 Ｐ