书 书 书犐犆犛 １１ ． ２２０ 犅 ４１ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 １７９９９ ． ３ — ２００８ 代替 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９．２ — １９９９ 犛犘犉 鸡 　 微生物学监测 第 ３ 部分 ： 犛犘犉 鸡 　 血清中和试验 犛犘犉犮犺犻犮犽犲狀 — 犕犻犮狉狅犫犻狅犾狅犵犻犮犪犾狊狌狉狏犲犻犾犾犪狀犮犲 — 犘犪狉狋 ３ ： 犛犲狉狌犿狀犲狌狋狉犪犾犻狕犪狋犻狅狀狋犲狊狋犳狅狉犛犘犉犮犺犻犮犽犲狀 　　 ２００８  １２  ３１ 发布 ２００９  ０５  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书中华人民共和国 国家标准 犛犘犉 鸡 　 微生物学监测 第 ３ 部分 ： 犛犘犉 鸡 　 血清中和试验 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９．３ — ２００８  中国标准出版社出版发行 北京复兴门外三里河北街 １６ 号 邮政编码 ： １０００４５ 网址 ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ 电话 ： ６８５２３９４６ 　 ６８５１７５４８ 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 各地新华书店经销  开本 ８８０×１２３０１ ／ １６ 　 印张 ０．７５ 　 字数 １４ 千字 ２００９ 年 ４ 月第一版 　 ２００９ 年 ４ 月第一次印刷  书号 ： １５５０６６ · １３６４９１ 如有印装差错 　 由本社发行中心调换 版权专有 　 侵权必究 举报电话 ：（ ０１０ ） ６８５３３５３３ 书 书 书前 　　 言 　　 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９ 《 ＳＰＦ 鸡 　 微生物学监测 》 分为 １０ 个部分 ： ——— 第 １ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 微生物学监测总则 ； ——— 第 ２ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 红细胞凝集抑制试验 ； ——— 第 ３ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 血清中和试验 ； ——— 第 ４ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 血清平板凝集试验 ； ——— 第 ５ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 琼脂扩散试验 ； ——— 第 ６ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 酶联免疫吸附试验 ； ——— 第 ７ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 胚敏感试验 ； ——— 第 ８ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 鸡白痢沙门氏菌检验 ； ——— 第 ９ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 试管凝集试验 ； ——— 第 １０ 部分 ： ＳＰＦ 鸡 　 间接免疫荧光试验 。 本部分为 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９ 的第 ３ 部分 。 本部分修订参照 ＯＩＥ 《 陆生动物 （ 哺乳动物 、 禽鸟和蜜蜂 ） 诊断试验和疫苗手册 》（ 第五版 ） 中的有关 规定 。 本部分代替 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９．２ — １９９９ 《 ＳＰＦ 鸡 　 血清中和试验 》。 本部分与 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９．２ — １９９９ 相比主要变化如下 ： ——— 增加了规范性附录 Ａ “ 试剂的配制 ”、 资料性附录 Ｂ “ 病毒接种技术 ” 以及资料性附录 Ｃ “ 鸡胚接 种病毒后的病变特征 ”； ——— 在试验内容部分 ， 增加了病毒的稀释梯度 ； ——— 对不同病毒致死鸡胚的时间重新确定 。 本部分附录 Ａ 为规范性附录 ， 附录 Ｂ 、 附录 Ｃ 为资料性附录 。 本部分由中华人民共和国农业部提出 。 本部分由全国动物防疫标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ１８１ ） 归口 。 本部分起草单位 ： 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 、 中国动物卫生与流行病学中心 、 济南斯帕法 斯家禽有限公司 。 本部分主要起草人 ： 曲连东 、 刘家森 、 韩凌霞 、 邵卫星 、 朱果 、 单忠芳 、 姜骞 、 司昌德 、 于海波 、 孟庆文 。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为 ： ——— ＧＢ ／ Ｔ１７９９９．２ — １９９９ 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 １７９９９ ． ３ — ２００８ 犛犘犉 鸡 　 微生物学监测 第 ３ 部分 ： 犛犘犉 鸡 　 血清中和试验 １ 　 范围 ＧＢ ／ Ｔ１７９９９ 的本部分规定了血清中和试验的技术要求 。 本部分适用于对 ＳＰＦ 鸡进行以下病毒中和抗体的检测 ： 禽脑脊髓炎病毒 （ ＡｖｉａｎＥｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ ）、 传染性支气管炎病毒 （ ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＢｒｏｎｃｈｉｔｉｓＶｉｒｕｓ ）、 传染性喉气管炎病毒 （ ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＬａｒｙｎｇｏ ｔｒａｃｈｅｉｔｉｓＶｉｒｕｓ ）、 传染性法氏囊病病毒 （ ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＢｕｒｓａｌＤｉｓｅａｓｅＶｉｒｕｓ ）。 ２ 　 原理 中和试验系指有生物活性的病毒与相应的抗体结合后 ， 失去原有的生物活性的中和反应 。 中和反 应不仅有高度特异性 ， 且具有严格的量的关系 。 因此可用中和试验鉴定病毒 ， 也可用于相应抗体的定量 检测 。 ３ 　 试剂和器材 ３ ． １ 　 试剂 ３ ． １ ． １ 　 病毒 ： 禽脑脊髓炎病毒 ＶａｎＲｏｅｋｅｌ 株 （ ＣＶＣＣＡＶ３５ ）、 传染性支气管炎病毒 Ｈ５２ （ ＣＶＣＣ ＡＶ１５１３ ）、 传染性法氏囊病病毒 Ａ８０ 株 （ ＣＶＣＶＡＶ２３２１ ）、 传染性喉气管炎病毒 Ａ９６ （ ＣＶＣＣＡＶ２００ ）。 ３ ． １ ． ２ 　 病毒稀释液 ： 胰蛋白胨磷酸盐肉汤 （ 见附录 Ａ ）。 ３ ． １ ． ３ 　 青霉素 ／ 链霉素 （ 双抗 ） 液 （ 见附录 Ａ ）。 ３ ． １ ． ４ 　 ３％ 碘酊溶液 。 ３ ． １ ． ５ 　 ＳＰＦ 胚蛋 。 ３ ． ２ 　 器材 ３ ． ２ ． １ 　 蛋钻 （ 打孔器 ）。 ３ ． ２ ． ２ 　 ６ 号针头 。 ３ ． ２ ． ３ 　 ７ 号针头 。 ３ ． ２ ． ４ 　 混合器 。 ３ ． ２ ． ５ 　 照蛋器 。 ４ 　 操作程序 ４ ． １ 　 试验准备 ４ ． １ ． １ 　 血清样品处理 被检血清和阳性对照血清经 ５６℃ 、 ３０ｍｉｎ ～ ４５ｍｉｎ 灭活补体 ， 保存于 －２０℃ 条件下备用 。 ４ ． １ ． ２ 　 犛犘犉 胚蛋准备 照胚检查胚体活力 ， 选取血管清晰 、 胚体规律摆动的健康胚蛋 ， 每个检测项目需胚蛋 ２４ 枚 。 ４ ． １ ． ３ 　 稀释病毒 ４ ． １ ． ３ ． １ 　 取灭菌试管 ４ 支 ～ ９ 支 ， 每管加入稀释液 ４ｍＬ 、 青霉素 ／ 链霉素液 ０．５ｍＬ 。 ４ ． １ ． ３ ． ２ 　 第 １ 管加入病毒液 ０．５ｍＬ ， 作连续 １０ 倍稀释 。 各种病毒的稀释度参见表 １ 。 １ 犌犅 ／ 犜 １７９９９ ． ３ — ２００８ 表 １ 　 病毒稀释 病 　　 毒 稀 　 释 　 度 禽脑脊髓炎病毒 １０ －１ ～ １０ －６ 传染性支气管炎病毒 １０ －１ ～ １０ －９ 传染性法氏囊病病毒 １０ －１ ～ １０ －６ 传染性喉气管炎病毒 １０ －１ ～ １０ －６ ４ ． ２ 　 中和试验 ４ ． ２ ． １ 　 血清准备 每份被检血清需 １．５ｍＬ 。 ４ ． ２ ． ２ 　 病毒稀释度选择 根据具体情况决定 ， 一般选择 ６ 个连续的病毒稀释度 。 检测 ＳＰＦ 鸡血清样品时 ， 病毒采用较高稀 释度 ， 如 １０ －３ ～ １０ －８ 。 检测阳性对照血清样品时 ， 病毒采用较低稀释度 ， 如 １０ －１ ～ １０ －６ 。 检测普通鸡血 清样品时 ， 病毒稀释度常采用 １０ －３ ～ １０ －７ 。 ４ ． ２ ． ３ 　 病毒与血清混合感作 将血清与不同稀释度的病毒等体积混合后 ， 经 ３７℃ 感作 ， 感作时间见表 ２ 。 表 ２ 　 血清与病毒混合感作时间 病 　　 毒 感作时间 ／ ｍｉｎ 禽脑脊髓炎病毒 ６０ 传染性支气管炎病毒 ３０ 或 ６０ 传染性法氏囊病病毒 ６０ 传染性喉气管炎病毒 ４５ ４ ． ２ ． ４ 　 接种鸡胚 ４ ． ２ ． ４ ． １ 　 病毒与血清混合感作后接种鸡胚 ， 每个稀释度接种 ４ 枚鸡胚 ， 每枚鸡胚接种 ０．２ｍＬ 。 ４ ． ２ ． ４ ． ２ 　 病毒对照 ： 将不同稀释度的病毒液 ， 分别接种鸡胚 ， 每个稀释度接种 ４ 枚鸡胚 ， 每枚鸡胚接 ０．１ｍＬ 。 ４ ． ２ ． ４ ． ３ 　 接种 ： 根据病毒种类选择接种方法 （ 见表 ３ ）。 表 ３ 　 病毒接种胚龄与方法 病毒种类 胚龄 ／ ｄ 接种方法 禽脑脊髓炎病毒 ５ ～ ７ ＹＳ 传染性支气管炎病毒 ９ ～ １０ ＣＡＳ 传染性法氏囊病病毒 １０ ＣＡＭ 传染性喉气管炎病毒 ９ ～ １０ ＣＡＳ 注 ： ＹＳ ——— 卵黄囊 ； ＣＡＳ ——— 尿囊腔 ； ＣＡＭ ——— 绒毛尿囊膜 （ 接种方法参见附录 Ｂ ）。 ４ ． ２ ． ５ 　 孵化 将接种后的鸡胚放入孵化器 ， 继续孵化 。 根据病毒不同 ， 选定不同的孵化时间 （ 见表 ４ ）。 ２ 犌犅 ／ 犜 １７９９９ ． ３ — ２００８ 表 ４ 　 接种鸡胚的孵化时间 病 　　 毒 孵化时间 ／ ｄ 禽脑脊髓炎病毒 １０ ～ １２ 传染性支气管炎病毒 ８ 传染性法氏囊病病毒 ７ 传染性喉气管炎病毒 ７ ４ ． ２ ． ６ 　 观察和记录 每日照胚 ， 记录各组鸡胚的死亡数 （ ２４ｈ 内死亡的鸡胚忽略不计 ）； 孵化期满 ， 记录各组鸡胚的感染 数 （ 参照附录 Ｃ 中的描述进行判定 ）。 ４ ． ２ ． ７ 　 计算中和指数 ４ ． ２ ． ７ ． １ 　 统计原理 结果以中和指数表示 ， 中和指数表示被检血清中有无中和抗体及中和病毒的能力 。 为求中和指数 ， 应计算出病毒对照和被检血清 ／ 病毒的 ＥＬＤ ５