IICS65.020.30 CCSB43 团体标准 T/SXSL16-2024 猪耳缘成纤维细胞培养技术规范 Technicalspecificationsforporcineearmarginfibroblastculture 2024-12-29发布 2025-01-29实施 陕西省饲料协会发布 全国团体标准信息平台 T/SXSL16-2024 Ⅰ前言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由陕西省饲料协会提出并归口。 本文件起草单位：西北农林科技大学、陕西正能农牧科技有限责任公司、杨凌衍数生物科技有限公 司、陕西省畜牧产业试验示范中心、陕西省畜牧技术推广总站、大荔县畜牧发展中心。 本文件主要起草人：胡建宏、温飞、冯贤辀、高磊、张毅、陈辉、连星、李胜、陈晓旭、郭松茂、 田佳卉、韩帅琪、胡张涛、贾永宏、于太永、张曼、杨晓茹、席华明、赵彩会、罗强。 本文件为首次发布。 本文件由西北农林科技大学负责解释。 单位：西北农林科技大学。 地址：陕西省咸阳市杨凌区邰城路3号。 电话：15600913628 邮编：712100 全国团体标准信息平台 T/SXSL16-2024 1猪耳缘成纤维细胞培养技术规范 1范围 本文件描述了猪耳缘成纤维细胞培养技术规范的术语与定义、溶液配制、供体选择、组织块获取、 原代培养、传代培养、细胞冻存、质量检测。 本文件适用于酶消化法分离培养猪耳缘成纤维细胞。 2.规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 DB65/T3502-2013绵羊耳缘皮肤组织成纤维细胞体外培养技术规程 NY/T3075-2017畜牧养殖场消毒技术 3术语与定义 3.1供体（Donor） 提供耳缘组织的猪。 3.2耳缘成纤维细胞（Earmarginfibroblast） 来自于耳缘的成纤维细胞。成纤维细胞是一种形态多样的细胞类型，呈梭型或不规则三角形，具 有卵圆形的核和突起的胞质。 3.3细胞培养（Cellculture） 在适当的条件下（37℃，5%CO2）培养，让细胞生长和增殖。 3.4细胞传代（Cellpassage） 将培养的细胞在一定的条件下进行分离、再培养的过程。 4试剂耗材及仪器设备 试剂耗材及仪器设备参照附录A执行； 溶液配制参照附录B执行。 5供体选择 符合品种特征，三代谱系清晰，健康的6月～12月龄种猪。 6组织块获取 全国团体标准信息平台 T/SXSL16-2024 2按照DB65/T3502-2013执行。 7原代培养 7.1将耳组织块用75%酒精清洗3次后，转移至PBS（含有5%双抗）中清洗3次，随后将其转入超净工 作台。 7.2用手术刀片刮去组织块表皮及皮下组织，保留真皮层，PBS冲洗2次后，将组织用无菌剪刀剪成1 mm3小块。 7.3用巴氏吸管将组织块转移至50mL离心管，使其自然沉淀，移去上清液，加入2mLPBS（含有2% 双抗），冲洗3次后，弃上清。 7.4加入25mL2%的Ⅰ型胶原酶，37℃水浴摇床中消化60min。 7.51500rpm离心5min后，弃去离心管中的胶原酶，并用PBS冲洗组织块3次。随后加入组织块:胰蛋 白酶=1:3～5的0.25%胰蛋白酶（含EDTA），置于37℃5%CO2培养箱消化。 7.6消化完毕后，加入完全培养基（10%FBS）终止消化，反复吹打后，40µm细胞筛过滤。 7.7将所得细胞悬液1200rpm离心5min，弃上清，加入完全培养基（10%FBS）重悬沉淀并接种于 细胞皿中，37℃5%CO2培养箱培养，待48h后观察细胞贴壁状态并更换培养基。 8传代培养 8.1细胞汇合度达到80%时，弃去原有的细胞培养液，加入PBS洗涤3次。 8.2弃去PBS，加入0.25%的胰蛋白酶（含EDTA），轻轻摇动使之均匀分散布满整个皿底。 8.3放入37℃5%CO2培养箱中3min后，在显微镜下观察细胞形态。 8.4当60%细胞变圆并开始脱落时，立即加入FBS终止消化。 8.5加入完全培养基，用移液枪轻轻吹打，使细胞团分散成单个细胞。 8.6当细胞全部脱落后，1200rpm离心5min，获得细胞沉淀，加入完全培养基重悬细胞并计数，按 3×105个细胞/6孔板的密度传代培养。 8.7细胞汇合度达到80%继续传代或冻存。 9细胞冻存 9.1当细胞汇合度至80%并处于对数生长期时，弃去细胞上清液，加入PBS洗涤2次。 9.2加入0.25%的胰蛋白酶（含EDTA）消化3min。 9.3当60%的细胞开始变圆并开始脱落时，立即加入含10%FBS培养基终止消化。 9.4用移液枪吹打皿底5～10次，收集培养液，1200rpm离心5min。 9.5弃上清，加入4℃预冷的细胞冻存液，调整细胞密度至5×105个/mL。 9.6按每管1mL细胞悬液的体积分装于无菌细胞冻存管中，严密封口。 9.7标明畜种、性别，细胞名称、代数，冻存编号、日期等信息。 9.8放入细胞冻存盒中，-80℃冰箱冷冻保存，16h后移入液氮保存。 10质量检测 10.1耳缘成纤维细胞的鉴定 10.1.1取耳缘成纤维细胞接种至24孔细胞培养板中，每孔1×104个细胞。 全国团体标准信息平台