DB37/ ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/SDVMA 005-2024 鉴别羊小反刍兽疫 IV系与疫苗毒株的荧光 RT-PCR方法 A fluorescence RT -PCR method for distinguishing ovine ruminant disease IV strain virus from vaccine virus 2024-12 -12 发布 2024 - 12 - 12实施 山 东 省 兽 医 协 会 发布 全国团体标准信息平台 T/SDVMA 005—2024 Ⅰ 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 -2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》给出的 规则起草 。 本文件由山东省兽医协会提出并归口。 本文件起草单位： 山东省滨州畜牧兽医研究院、山东绿都生物科技有限公司、深圳市康百得生物科 技有限公司 。 本文件主要起草人： 王金良、孟卫芹、姚春阳、莫玲、邓凤林、徐倩倩、陈金龙、徐晴晴、唐娜、 郭时金、胡绍良。 全国团体标准信息平台 T/SDVMA 005—2024 1 鉴别羊小反刍兽疫 IV系与疫苗毒株的荧光 RT-PCR方法 1 范围 本文件规定了羊小反刍兽疫 IV系与疫苗毒株（ Clone 9株） SYBR Green I 荧光 RT-PCR鉴别检测要 求。 本文件适用于羊小反刍兽疫 IV系与疫苗毒株（ Clone 9株）的鉴别检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 试验原理 SYBR Green I 是一种只与双链 DNA小沟结合的染料。在 RT-PCR反应体系中，采用特异的引物， 将RNA逆转录形成 cDNA，当 SYBR Green I 荧光染料与 cDNA双链结合时，荧光信号增强，从 cDNA 双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。随着 PCR反应的进行，每经过一个循环，收集一次荧光强度 信号，就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。与此同时，随温度升 高， DNA的双螺旋结构发生降解，全部 DNA双螺旋结构降解一半的温度称为熔解温度（ Tm），不同 序列的 DNA，Tm值不同。 DNA中G－C含量越高， Tm值越高，成正比关系，通过 Tm值的差异可以 实现对扩增产物的鉴别。 5 试剂或材料 除非另有说明，所用试剂均为分析纯。 5.1 水， GB/T 6682 ，一级。 5.2 焦碳酸二乙酯（ DEPC）水：取 1 mL DEPC 加入水至 1 000 mL，充分震荡混匀，静置 24 h后， 全国团体标准信息平台 T/SDVMA 005—2024 2 121 ℃高压灭菌 15 min，4 ℃保存备用。 5.3 磷酸盐缓冲溶液（ PBS）：取 Na2HPO 4•12H 2O 2.9 g，KCl 0.2 g，KH 2PO4 0.2 g，NaCl 8 g，溶于 800 mL水中， 充分搅拌溶解， 滴加浓盐酸将 pH调节至 7.4， 加水定容至 1 000 mL，121 ℃高压灭菌 15 min， 4 ℃保存备用。 5.4 引物：引物名称和序列见附录 A。 5.5 商品化病毒核酸提取试剂盒。 5.6 商品化一步法荧光 RT-PCR反应试剂。 5.7 小反刍兽疫疫苗毒株阳性对照：市售商品化小反刍兽疫弱毒疫苗。 5.8 小反刍兽疫疫苗毒株阴性对照： DEPC水。 5.9 小反刍兽疫 IV系毒株阳性对照：含有小反刍兽疫 IV系毒株扩增目的基因的 DNA质粒。 5.10 小反刍兽疫 IV系毒株阴性对照： DEPC水。 6 仪器设备 6.1 二级生物安全柜。 6.2 荧光 PCR仪。 6.3 电子天平：精度 0.01 g。 6.4 高速冷冻离心机：可控温至 4 ℃，转速 ≥12 000 r/min 。 6.5 超低温冰箱：可控温至 -70 ℃以下。 6.6 高压蒸汽灭菌器。 7 样品 7.1 采样 7.1.1 采样注意事项：采样过程中应按照 NY/T 541 执行，采样及样品处理过程中做好个人防护，样品 间不得交叉污染。 7.1.2 样品采集：发病羊只采集眼结膜拭子 2个、鼻黏膜拭子 2个、颊部拭子 1个，分别放在 300 μL 灭菌的 PBS中。无菌采集血液 10 mL，用常规方法分离血清。 组织样品为扑杀或死亡时间不超过 24 h 的病畜。无菌采集肠系膜和支气管淋巴结各 3～4个，脾、胸腺、肠黏膜和肺等组织各约 25 g～50 g， 分别置于 50 mL离心管中。 肉制品取 25 g ～50 g，置于 50 mL离心管中。 7.2 样品保存与运输 7.2.1 保存：采集样品在 2 ℃ ～8 ℃条件下保存，时间应不超过 24 h；若需要长期保存，应放置 -70 ℃ 冰箱。 7.2.2 运输：采集的样品密封后，采用保温箱加冰密封，在 2 ℃ ～8 ℃条件下 24 h内运送到实验室。 按《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。 全国团体标准信息平台