DB37/ ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/SDVMA 004-2024 鉴别羊痘病毒与羊传染性脓疱病毒的双重 荧光定量 PCR方法 A dual fluorescent quantitative PCR method for distinguishing ovine pox virus from orf virus 2024-12 -12 发布 2024 - 12 - 12实施 山 东 省 兽 医 协 会 发布 全国团体标准信息平台 T/SDVMA 004—2024 Ⅰ 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 -2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》给出的 规则起草 。 本文件由山东省兽医协会提出并归口。 本文件起草单位： 山东省滨州畜牧兽医研究院、 西南大学、滨州市疾病预防控制中心、深圳市康百 得生物科技有限公司、 山东绿都生物科技有限公司 、聊城职业技术学院 。 本文件主要起草人： 王金良、叶超、张丽芳、王海丽、孟卫芹、魏凤、邓凤林、徐倩倩、姚春阳、 莫玲、徐晴晴、吕素芳、郭广君、唐娜、郭时金、陈金龙、胡绍良。 全国团体标准信息平台 T/SDVMA 004—2024 1 鉴别羊痘病毒与羊传染性脓疱病毒的双重荧光定量 PCR方法 1 范围 本文件规定了 羊痘病毒与羊传染性脓疱病毒 荧光定量 PCR方法样品采集、保存与运输，以及鉴别 检测要求 。 本文件适用于 羊痘病毒与羊传染性脓疱病毒 的鉴别检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 4 试剂或材料 除非另有说明，所用试剂均为分析纯。 4.1 水，GB/T 6682 ，一级。 4.2 磷酸盐缓冲溶液（ PBS）：取Na2HPO4•12H2O 2.9 g，KCl 0.2 g，KH2PO4 0.2 g，NaCl 8 g，溶于800 mL水中， 充分搅拌溶解， 滴加浓盐酸将 pH调节至7.4 ， 加水定容至 1 000 mL，121 ℃高压灭菌 15 min， 4 ℃保存备用。 4.3 引物：引物名称和序列见附录 A 。 4.4 商品化病毒核酸提取试剂盒。 4.5 商品化荧光定量 PCR 反应试剂。 4.6 羊痘病毒阳性对照：含有扩增羊痘病毒目的基因序列的质粒 DNA。 4.7 羊传染性脓疱病毒阳性对照：含有扩增羊传染性脓疱病毒目的基因序列的质粒 DNA。 4.8 阴性对照：灭菌水。 全国团体标准信息平台 T/SDVMA 004—2024 2 5 仪器设备 5.1 电子天平：精度 0.01 g。 5.2 荧光定量 PCR检测仪。 5.3 高速冷冻离心机：可控温至 4 ℃，转速 ≥12 000 r/min。 5.4 高压蒸汽灭菌器。 5.5 二级生物安全柜。 5.6 超低温冰箱：可控温至 -70 ℃以下。 6 样品采集、保存与运输 6.1 采样注意事项： 采样过程中应按照 NY/T 541规定执行，采样及样品处理过程中做好个人防护，样 品间不得交叉污染。 6.2 组织样品采集： 发病活体羊的皮肤丘疹、鼻唇部 脓疱或硬痂 、口腔拭子或病死剖检羊的肺、淋巴 结等组织 5 g～10 g，装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号标记，置于样品冷藏箱送至实验室。 6.3 保存：采集样品在 2℃～8℃条件下保存，时间应不超过 24 h；若需要长期保存，应放置 -70℃冰 箱。 6.4 运输：采集的样品密封后，采用保温箱加冰密封，在 2℃～8℃条件下 24 h内运送到实验室。做 好生物安全标识。 7 试验步骤 7.1 样品处理 7.1.1 组织样品：样品加入 5倍体积灭菌水，充分研磨， 4 ℃、10 000 r/min 离心5 min，取上清液 转入离心管中编号备用。 7.1.2 细胞培养物： 1 mL 细胞培养物置于离心管内，反复冻融 3 次，4 ℃、10 000 r/min 离心 10 min，取上清液转入离心管中编号备用。 7.1.3 疫苗样品：加入 2 mL 的 PBS，溶解，混匀， 4 ℃、10 000 r/min 离心10 min，取上清液转入 离心管中编号备用。 7.2 核酸提取 按照GB 19489 规定执行，采用商品化试剂盒提取病毒核酸。 7.3 荧光定量 PCR检测 7.3.1 反应体系的配制： 见附录B。 7.3.2 加样：在各设定的荧光 PCR管中分别加入阳性对照、阴性对照和提取的试样核酸溶液 2 μL，盖 全国团体标准信息平台