DB37/ ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/SDVMA 002-2024 鸭甲肝病毒 3型荧光RT-PCR检测技术 Real-time RT -PCR for detection of duck hepatitis A virus type 3 2024-12 -12 发布 2024 - 12 - 12实施 山 东 省 兽 医 协 会 发布 全国团体标准信息平台 T/SDVMA 002-2024 I 前 言 本文件按照 GB/T 1/1 -2020《标准化工作导则第 1 部分:标准化文件的结构和起草规则》 给出的规 则起草。 本文件由 山东省兽医协会 提出并归口。 本文件起草单位： 山东省动物疫病预防与控制中心（山东省人畜共患病流调监测中心）、青岛嘉智 生物技术有限公司、青岛新牧至康生物技术有限公司、山东省农业科学院家禽研究所、山东新希望六和 集团有限公司、青岛市即墨区畜牧业发展服务中心。 本文件主要起草人： 兰邹然、秦立廷、魏笑笑、黄兵、马秀丽、王苗利、刘志杰、戴荣莲、李波、 杨晓雪、赵鲁、陈婷、孙爱荣、孙伟、武梅、王秋珍、李晓菲、高绪慧。 全国团体标准信息平台 T/SDVMA 002-2024 1 鸭甲肝病毒 3型荧光RT-PCR检测技术 1 范围 本文件规定了鸭甲肝病毒 3型实验室诊断样品采集与处理，以及荧光 RT-PCR检测方法。 本文件适用于鸭甲肝病毒 3型的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3.缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DHAV-3：鸭甲肝病毒 3型病毒（ duck hepatitis A virus type 3 ） 荧光 RT-PCR：荧光反转录聚合酶链式反应（ real-time reverse transcript polymerase chain reaction ） Ct值：荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数（ cycle threshold ） RNA：核糖核酸（ ribonucleic acid ） 4 仪器设备和试剂耗材 4.1 仪器设备 4.1.1 荧光定量 PCR扩增仪。 4.1.2 生物安全柜。 4.1.3 高速冷冻离心机。 4.1.4 核酸提取仪。 4.1.5 恒温培养箱。 4.1.6 微量移液器。 4.2 试剂耗材及实验参照物 除非另有说明，在检测中使用的化学试剂均为分析纯，实验室用水应符合 GB/T 6682 的要求。 全国团体标准信息平台 T/SDVMA 002-2024 2 4.2.1 氯仿：分析纯，常温保存。 4.2.2 异丙醇：分析纯，使用前预冷至 -20 ℃。 4.2.3 无RNA酶水。 4.2.4 实时荧光 RT-PCR反应液。 4.2.5 阳性参照物（鸭甲肝病毒 3型病毒）。 4.2.6 阴性参照物（鸭肝脏组织）。 5 采样和样品前处理 5.1 样品采集 5.1.1 活体及病死鸭采样：按 NY/T 541 要求无菌采集发病鸭的肝脏组织。 5.1.2 病毒培养物：取 5.2.1中处理好的上清液经尿囊腔接种 9 日龄～ 11 日龄鸭甲肝病毒 3型病毒抗体 阴性鸭胚， 0.1 mL/枚，共 5 枚。封口后置于 37 ℃恒温培养箱继续孵化，每日照胚 2 次，记录鸭胚死亡 情况，观察到第 6天。收集接种后 24 h ～ 96 h的死亡鸭胚 病毒培养物。 5.2 样品前处理 5.2.1 组织样品处理： 取肝脏组织 2 g～10 g，加入 10倍体积生理盐水，用剪刀剪碎后，置于研磨器 中充分研磨，反复冻融 2次～ 3次， 8 000 r/min 离心 10 min，取上清液 200 µL用于 RNA提取。 5.2.2 病毒培养物处理：无菌收集培养 24 h～96 h的鸭胚尿囊液， -20 ℃保存备用。 6 存放与运输 采集或处理的样本在 2 ℃～8 ℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，需放置 -80 ℃冰箱，但 应避免反复冻融。采集或处理的样品需要运输时，需冷链运输。 7 RNA提取 7.1 在100 µ L病料上清液中加入 1 mL 裂解液，剧烈颠倒 50 次～ 100 次，室温静置 10 min后，加入 200 µ L氯仿，上下颠倒 50次～ 100次，室温静置 5 min～10 min，于 4 ℃ 12 000 r/min离心 10 min。 7.2 吸取上清加入等体积氯仿，上下颠倒 50次～ 100次，于 4℃ 12 000 r/min离心 10 min。 7.3 吸取上清加入等体积的 -20 ℃预冷的异丙醇，轻轻混匀后， -20 ℃静置至少 30 min，然后于 4 ℃ 12 000 r/min离心 15 min～20 min。 7.4 弃上清液，加入 1 mL预冷的 75 % 酒精， 12 000 r/min离心 5 min～10 min。 7.5 弃上清液，倒置自然晾干，或 12 000 r/min 再离心 5 min，吸掉管底部的液体。 全国团体标准信息平台