ICS 67.160.10 CCS C 151 T/NAIA 团 体 标 准 T/ NAIA 0346—2024 葡萄酒中褪黑素及其代谢物 2-羟基褪黑 素、6-羟基褪黑素的测定 高效液相色谱 -串联质谱法 Determination of melatonin and 2-hydroxy-melatonin 、 6-hydroxy-melatonin in wine HPLC-MS/MS 2024-12- 03发布 2024-12- 15实施 宁夏化学分析测试协会 发 布 全国团体标准信息平台 T/NAIA 0346—2024 I前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》规定 编写。 本文件由宁夏化学分析测试协会提出并归口。 本文件起草单位 ：宁夏回族自治区食品检测研究院（国家葡萄酒质量检验检测中心、国家市场 监管重点实验室（枸杞及葡萄酒质量安全） ）、宁夏贺兰山东麓葡萄酒产业园区管理委员会 、宁夏 长和翡翠酒庄有限公司、宁夏化学分析测试协会。 本文件主要起草人 ：马雪梅、马桂娟、汤丽华、朱燕燕、王鹏、周叶丽、章苒、刘竞择、王琛、 刘继辉、郭阳、吕毅、张小飞。 全国团体标准信息平台 1葡萄酒中褪黑素及其代谢物 2-羟基褪黑素 、6-羟基褪黑素的测定 高效液相色谱 -串联质谱法 1 范围 本文件规定了 葡萄酒中褪黑素及其代谢物 2-羟基褪黑素 、6-羟基褪黑素的高效液相色谱 -串联质 谱检测方法。 本文件适用于 葡萄酒中褪黑素及其代谢物 2-羟基褪黑素、 6-羟基褪黑素的测定和确证。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682分析实验室用水规格和实验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 试样经 N-丙基乙二胺（ PSA）净化后，经反相色谱柱分离，以保留时间定性，供高效液相色 谱-串联质谱仪测定和确证，外标法定量。 5 试剂和材料 本方法所用的试剂，除另有规定外，均为分析纯， 水为 GB/T 6682规定的一级水。 5.1试剂 5.1.1 乙腈：色谱纯。 5.1.2 甲酸：优级纯。 5.1.3 N-丙基乙二胺（ PSA）粉末。 5.1.4 0.1%甲酸溶液： 取0.1mL甲酸用水 定容到 100mL。 5.1.5 50%乙腈溶液： 取50mL乙腈用水 定容到 100mL。 5.2 标准品 5.2.1标准品： 褪黑素（Melatonin,MT ，CAS号73-31-4）纯度： 99.8%、2-羟基褪黑素（ 2-Hydroxy Melatonin ，CAS号229018-17-1 ）纯度： 96%、6-羟基褪黑素（ 6-Hydroxy Melatonin ，CAS号 2208-41-5 ）纯度：98%。 5.2.2标准储备液（ 100.0μg/mL ）：分别准确称取 褪黑素、 2-羟基褪黑素、 6-羟基褪黑素 标准物质约 10mg（精确至 0.1mg），用甲醇溶解并定容至 100mL容量瓶中 ,配制成 100.0μ g/mL的标准储备溶液 ， 避光贮存。 全国团体标准信息平台 T/NAIA 0346—2024 25.2.3 混合标准溶液 ：分别准确吸取 褪黑素、 2-羟基褪黑素、 6-羟基褪黑素标准储备液 各1.0 mL于 10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度， 配制成 10.0μ g/mL的混合标准储备液 ,避光贮存。 5.2.4 标准工作溶液：分别用移液器准确吸取不同体积混合标准溶液， 用50%乙腈溶液定容至 1.0 mL，配制成 褪黑素、 2-羟基褪黑素、 6-羟基褪黑素 的浓度分别为 1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、 100.0、200.0 ng/mL的系列标准工作溶液，临用现配。 6 仪器和设备 6.1 液相色谱 -串联质谱仪：配备电喷雾离子源。 6.2 天平：感量 0.1mg和0.001g。 6.3 涡旋混合器。 6.4 高速冷冻离心机： 最大转速 13000r/min 。 6.5 移液器： 量程 200μ L和1000μL。 7 分析步骤 7.1 试液的提取 吸取 2mL（精确至 0.01mL）混匀的葡萄酒样品 (含气体的酒样应提前超声去除气体 )于含有 50mg N-丙基乙二胺（ PSA）的净化管中， 充分涡旋 10min后经 10000 rpm/min离心5min。移取上 清液经 0.22μ m滤膜过滤后，经高效液相色谱 -串联质谱（ HPLC-MS/MS ）进行分析。 7.2 仪器参考条件 7.2.1 液相色谱参考条件 7.2.1.1 色谱柱： C18，2.1mm×100mm，粒径 3.5μm或性能相当。 7.2.1.2 柱温： 30℃。 7.2.1.3 流动相： A：水（含0.1%甲酸）， B：乙腈； 梯度洗脱见表 1。 7.2.1.4 流速： 0.25mL/min 。 7.2.1.5 进样量： 5μL。 表1 流动相及梯度洗脱条件 时间 /min 流速 /（mL/min） 流动相 A/% 流动相 B/% 0.0 0.25 90 10 1.0 0.25 90 10 3.0 0.25 50 50 5.0 0.25 50 50 7.0 0.25 10 90 8.0 0.25 10 90 8.1 0.25 90 10 10.0 0.25 90 10 7.2.2 质谱参考条件 7.2.2.1 离子源：电喷雾离子源（ ESI）。 7.2.2.2 扫描方式：正离子扫描。 7.2.2.3 检测方式：多反应监测（ MRM）。 全国团体标准信息平台