ICS65.020.99 CCSB05 GXTC 团体标准 T/GXTC0015—2024 菠萝蜜抗寒基因挖掘技术规范基于转录组 测序技术 Technicalspecificationofjickfruitcoldresistancegeneminingbasedon transcriptomesequencingtechnology 2024-11-29发布 2024-12-06实施 广西热带作物学会  发布 全国团体标准信息平台 T/GXTC0015—2024 I前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由广西壮族自治区亚热带作物研究所提出并宣贯。 本文件由广西热带作物学会归口。 本文件起草单位：广西壮族自治区亚热带作物研究所。 本文件主要起草人：杜英俊、朱鹏锦、唐秀观、钟云婕、何江、欧景莉、叶维雁。 全国团体标准信息平台 T/GXTC0015—2024 1菠萝蜜抗寒基因挖掘技术规范基于转录组测序技术 1范围 本文件界定了菠萝蜜抗寒基因挖掘基于转录组测序技术的术语和定义，给出了技术原理，并规定了 仪器设备及试剂、品种选择与使用、转录组测序流程、生物信息学分析的要求。 本文件适用于筛选菠萝蜜抗寒基因。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T35890高通量测序数据序列格式规范 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 转录组测序transcriptomesequencing 通过二代测序平台快速全面地获得某一物种特定细胞或组织在某一状态下的几乎所有的转录本及 基因序列，可以用于研究基因表达量、基因功能、结构、可变剪接和新转录本预测等。 fastq格式fastqformat 基于文本的、保存生物序列（通常是核酸序列）和其测序质量信息的、每四行表示一条序列的标准 格式。 质量控制qualitycontrol 对测序仪下机的原始数据进行质量评估，具体内容包括含N比例、GC含量、序列重复情况、序列长 度分布情况、碱基平衡情况等。 测序片段sequencingfragment 高通量测序平台产生的含有碱基序列和质量值的序列片段。 差异表达基因differentiallyexpressedgenes（DEGs） 通过阈值法、统计法或者其他检验方法，筛选出组间的表达水平存在显著差异的基因。 差异倍数foldchange 根据同一个基因或转录本在不同条件下表达丰度差异的倍数。 4原理 根据基因在不同样品中的表达量识别差异表达基因，并对其进行功能注释和富集分析，筛选差异表 达基因。 5仪器设备及试剂 全国团体标准信息平台 T/GXTC0015—2024 2仪器：Illumina高通量测序平台、琼脂糖凝胶电泳仪、分光光度计、荧光计、生物分析仪。 试剂：RNA提取试剂盒。 6品种选择与使用 6.1品系选取 选取生长势一致耐寒品系(GXRZBLM00051，编号为A)和不耐寒品系(GXRZBLM00006，编号为B), 低温胁迫（3 ℃～4 ℃）后A正常生长发育，没有出现寒害症状；而B出现寒害症状，其叶背面出现水 浸状斑块，叶组织变成褐色或深褐色，后呈现青枯状。 6.2样品制备 分别选取两个品系的菠萝蜜各5棵树，从东南西北四个方向随机采集叶片，将叶片用去离子水 （ddH₂O）洗净后放液氮中速冻，带回实验室-80 ℃冻存。 7转录组测序流程 总RNA提取 总RNA的提取采用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒，操作按照RNA提取试剂盒说明书进行。 RNA检测 分析RNA的完整性及是否存在DNA污染；检测RNA纯度（OD260/280和OD260/230）；测定RNA浓 度。 检测RNA完整性。 文库构建 按下列步骤执行： a)富集带有polyA尾的mRNA； b)将RNA打断成短片段； c)合成第一链cDNA； d) 合成二链cDNA； e)纯化双链cDNA； f)双链cDNA末端修复、加A尾并连接测序接头； g)片段大小选择； h)PCR富集得到最终的cDNA文库。 文库质检 7.4.1初步定量 使用荧光计进行初步定量，使用生物分析仪对文库的插入片段长度（insertsize）进行检测，插入片 段长度符合预期后才可进行下一步实验。 7.4.2准确定量 运用Q-PCR（荧光定量PCR）方法对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度＞2 nM），完成 库检。 上机测序 库检合格后，用Illumina平台进行测序，测序后得到原始数据。原始数据为fastq格式。 全国团体标准信息平台