全国团体标准信息平台 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规 则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国食品科学技术学会提出并归口。 本文件起草单位:中国食品发酵工业研究院有限公司、国家食品安全风险评估中心、汤臣倍健股份 有限公司、山西大学、发酵行业生产力促进中心、丹尼斯克(中国)有限公司、内蒙古伊利实业集团股份 有限公司、内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司、光明乳业股份有限公司、北京科拓恒通生物技术股份 有限公司、微康益生菌(苏州)股份有限公司。 本文件主要起草人:姚粟、郭立峥、徐进、赵溪、迮晓雷、张国华、刘艺茹、冯会粉、葛媛媛、郭茸凯、 路春霞、马霞、王玉琼、张旭光、毛跃建、张锋华、马杰、方曙光、夏九学。T/CIFST 020—2024 全国团体标准信息平台 食品用菌种检验 鼠李糖乳酪杆菌检验PMA-qPCR法 1 范围 本文件规定了食品中鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)的PMA-qPCR检验方法。 本文件适用于食品原料和固体饮料中鼠李糖乳酪杆菌的活菌定量检验。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB 4789.35—2023 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403—2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 实时荧光定量PCR quantitative real-time polymerase chain reaction 在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,对未知模板 DNA进行定量分析的方法。 3.1.2 Ct值 cycle threshold value 实时荧光定量PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CFU:菌落形成单位(colony forming units) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid) LED:发光二极管(light emitting diode) OD:光密度(optical density) PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction) PMA:叠氮溴化丙锭(propidium monoazide) qPCR:实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction) ROX:一种荧光染料(carboxy-X-rhodmine) 1T/CIFST 020—2024 全国团体标准信息平台 4 原理 PMA是一种能与DNA结合的光反应染料,可透过受损细胞膜与菌体DNA发生共价交联,从而 抑制受损菌体DNA的qPCR扩增。样品经PMA染料处理、DNA提取后,采用鼠李糖乳酪杆菌特异性 引物进行qPCR扩增。细胞膜结构完整的活菌菌体DNA在qPCR扩增反应中能够产生荧光信号。当 扩增产物的荧光信号达到设定阈值时,可被实时检测并生成Ct值,将Ct值代入标准曲线方程中,计算 获得样品中鼠李糖乳酪杆菌的活菌数量。 5 仪器设备 5.1 实时荧光定量PCR仪。 5.2 高速台式冷冻离心机:0~20 000 r/min。 5.3 酶标仪。 5.4 恒温培养箱:36 ℃±1 ℃。 5.5 生物安全柜或超净工作台。 5.6 冰箱:2 ℃~5 ℃、-30 ℃~-20 ℃。 5.7 涡旋振荡仪。 5.8 LED光解仪:最大功率60 W,频率50 Hz~60 Hz,LED输出波长465 nm~475 nm。 5.9 珠式样品研磨器:速度0.8 m/s~8 m/s。 5.10 拍打式均质器。 5.11 高压灭菌锅。 5.12 天平:精度0.01 g。 5.13 微量可调移液器及配套吸头:0.5 μL~10 μL、10 μL~100 μL、100 μL~1000 μL。 6 试剂或材料 除特别说明外,仅使用分析纯或生化试剂,实验用水应符合GB/T 6682中一级水。 6.1 无菌均质袋。 6.2 无菌离心管:1.5 mL。 6.3 无菌玻璃珠:粒径0.1 mm。 6.4 无菌研磨管:2 mL。 6.5 荧光定量PCR 8连排管或96孔板。 6.6 96孔细胞培养板。 6.7 MRS(Man Rogosa Sharpe)琼脂培养基:见GB 4789.35—2023附录A中A.2。 6.8 PMA溶液:浓度20 mmol/L。 6.9 无菌超纯水或无菌双蒸水。 6.10 0.85%无菌生理盐水:见GB 4789.35—2023附录A中A.8。 6.11 实时荧光定量PCR混合试剂。 6.12 ROX参比染料(50×)。 6.13 阳性对照:鼠李糖乳酪杆菌CICC 6224T(=ATCC 7469T)菌株DNA或扩增片段的阳性克隆分 子DNA。 2T/CIFST 020—2024 全国团体标准信息平台