ICS 11.220 B 41 备案号：35740-2013 吉 林 DB22 省 地 方 标 准 DB 22/T 1606—2012 副猪嗜血杆菌病诊断技术规程 Technical specification of diagnosis for Haemophilus parasuis 2012 - 12 - 01 发布 吉林省质量技术监督局 2013 - 01 - 01 实施 发 布 DB22/T 1606—2012 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。 本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心。 本标准主要起草人：孟日增、石建平、孟庆峰、宋战昀、蔡阳、王振国、王伟利、肖成蕊、王为。 I DB22/T 1606—2012 副猪嗜血杆菌病诊断技术规程 1 范围 本标准规定了副猪嗜血杆菌病的综合诊断技术（临床诊断、病原分离鉴定、聚合酶链式反应、间接 血凝试验）。 本标准适用于养猪场或散养猪副猪嗜血杆菌病现场诊断与实验室诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程 NY/T 541 动物疫病实验室检验采样方法 3 临床诊断 3.1 流行性病学 副猪嗜血杆菌，其病原特征参见附录A，该菌只感染猪，常感染2周龄～ 16周龄的猪，5周龄～8周 龄的猪更易感。该病主要通过呼吸系统传播，猪与猪之间的接触及排泄物亦可传播，主要传染源为病猪 和带菌猪。该病发病率一般在10% ～15 %，严重时死亡率可达到50%。 3.2 临床症状 急性病例表现为发热、食欲不振和厌食，严重时可见呼吸困难、发绀、不愿活动、关节肿胀、跛行、 运动不协调以及死亡。病程较长猪只的体温大都正常，常表现为食欲不振、消瘦、被毛粗乱，其行为主 要表现为跛行、关节肿胀。急性发病耐过猪可以痊愈，但病症严重，猪耐过后往往表现慢性病症，主要 是被毛粗乱、咳嗽、呼吸困难和生长迟滞。有些猪由于发生脑膜炎而表现肌肉震颤、麻痹和惊厥，有些 因腹膜粘连而常引起肠梗阻。 3.3 病理学变化 剖检可见浆液性或纤维素性胸膜炎、腹膜炎、心包炎、关节炎及脑膜炎，损伤或渗出可波及关节表 面，尤其是腕关节和跗关节。肺脏出血、表面有纤维素性渗出物附着，全身淋巴结水肿、出血。在显微 镜下观察渗出物，可见纤维蛋白，中性粒细胞和较少量的巨噬细胞。病死猪及病料的处理应符合 GB 16548 的规定。 4 病原分离与鉴定 4.1 试剂与材料 1 DB22/T 1606—2012 4.1.1 水 为符合GB/T 6682的灭菌二级水。 4.1.2 培养基 巧克力琼脂，鲜血琼脂培养基，大豆酪蛋白琼脂固体培养基（TSA） ，胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB） 。 4.1.3 标准菌株 副猪嗜血杆菌标准菌株，由指定单位提供。 4.2 仪器 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4 恒温培养箱：35 ℃±1 ℃。 灭菌培养皿：直径 90 mm 至 100 mm。 细菌微量生化鉴定管。 灭菌棉拭子。 4.3 病料采集 按NY/T 541规定的方法，采集病料。病料可包括呼吸道分泌物或具有病变特征的肺脏、肝脏、脾脏、 胸膜、胸腹腔渗出浆液、心包积液、心血、关节液和脑组织。 4.4 病原分离 4.4.1 采集样品，首先在巧克力琼脂平板、TSA 固体培养基、鲜血琼脂平板上分别划线接种，37 ℃培 养 48 h～72 h 以后挑取单个菌落，再进行纯培养并鉴定。 4.4.2 细菌涂片，革兰氏染色镜检。如果为革兰氏阴性小杆状或多形性小杆菌，再进行一次巧克力琼 脂亚克隆培养，同时接种鲜血琼脂平板和普通琼脂平板。 4.4.3 巧克力琼脂平板生长良好，而鲜血琼脂平板和普通琼脂平板没有菌落生成则菌株保存待进一步 鉴定。 4.5 病原鉴定 4.5.1 生长特性试验 挑取被检分离株和副猪嗜血杆菌标准株菌落接种绵羊鲜血琼脂平板和2%胨琼脂平板上，再以金黄色 葡萄球菌点种或垂直划线，置37 ℃培养48 h。 观察葡萄球菌菌落周围菌落生成情况，如愈靠近金黄色葡萄球菌菌落愈大，菌落呈圆形、隆起、闪 光、半透明；离葡萄球菌愈远则菌落愈小，甚至不见菌落生长，且不出现溶血现象判为阳性。 4.5.2 生化实验 培养物接种于添加有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的脲酶、氧化酶、吲哚，接触酶、葡萄糖、麦 芽糖、蔗糖、果糖、核糖、半乳糖、硝酸盐还原酶等细菌微量生化鉴定管，置37 ℃培养48 h。按细菌 微量生化鉴定管说明书判定。 脲酶试验、氧化酶试验、吲哚试验均阴性，并且接触酶、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、核糖、半 乳糖、硝酸盐还原试验均阳性者判为副猪嗜血杆菌阳性。 4.5.3 动物回归试验 2 DB22/T 1606—2012 对分离菌株接种4周龄～6周龄非免疫猪，临床观察符合3.2且与病理剖检变化符合3.3，采集病料分 离培养满足4.5.1与4.5.2，则可判为动物回归试验阳性。 4.5.4 结果判定 经生长特性试验、生化试验、动物回归试验检测确定均为阳性者，可判为副猪嗜血杆菌分离阳性。 5 聚合酶链式反应（PCR） 5.1 试剂与材料 5.1.1 对照品 副猪嗜血杆菌标准菌株DNA提取物为阳性对照，水作为阴性对照。 5.1.2 rTaq 酶 5 U/μL，保存于-20 ℃，避免反复冻融或温度剧烈变化，随用随取。 5.1.3 10 倍 PCR 缓冲液 Mg2+浓度 25 mmol/L。 5.1.4 dNTP 混合液（2.5 mmol/L） 含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP 四种脱氧核苷酸。 5.1.5 蛋白酶 K 浓度为 10 mg/mL。 5.2 引物 PCR引物P1 5′- GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT – 3′和P2 5′- GGC TTC GTC ACC CTC TGT – 3 ′。 5.3 仪器 5.3.1 5.3.2 5.3.3 5.3.4 5.3.5 5.3.6 5.3.7 5.3.8 PCR 扩增仪。 电泳仪。 凝胶成像分析仪。 离心机：转速可达到 12000 r/min 或以上。 组织匀浆器或研磨器。 普通冰箱：-20 ℃或以下。 低温冰箱：-70 ℃或以下。 微量移液器：0.1 μL～2.5 μL、 2 μL～20 μL、20 μL～200 μL、100 μL～1000 μL。 5.4 PCR 样品采集与处理 按NY/T 541规定的方法，采集待检猪的病料置于-20 ℃保存。取约1 g病料，剪碎后匀浆器加5 mL 水研磨成糊状，煮沸10 min，高速10000 r/min离心5 min，取上清-20 ℃保存备用。另外，按GB 16548 规定处理待检猪。取可疑培养物10000 r/min 离心5 min，弃上清，沉淀以无菌水重悬，煮沸10 min， 3 DB22/T 1606—2012 高速10000 r/min离心5 min，取上清-20 ℃保存备用。分离纯化的菌株用接种环刮取2个菌落洗脱于含 100 μL无菌水的离心管，煮沸10 min，高速10000 r/min离心5 min，取上清-20 ℃保存备用。 5.5 DNA 模板的制备 采用商品化DNA提取试剂盒进行DNA模板的制备，按操作说明书进行。 5.6 PCR 反应体系 2+ 10×PCR Buffer 2.5 μL，Mg （25 mM）1.3 μL，P1（20 pmol/μL）1.0 μL，P2（20 pmol/μL） 1.0 μL，dNTPs（2.5 mM）2.0 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL） 0.5 μL，模板2 μL ～5 μL，加ddH2O至总体 积 25 μL。 5.7 PCR 反应条件 94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，34个循环，72 ℃ 10 min。 5.8 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳 制备1 %琼脂糖凝胶，内加适量溴化乙锭或其替代物，取PCR产物10 μL ～ 20 μL分别与适量加样 缓冲液混合后，加入到样品孔，9 V/cm恒压下电泳15 min ～ 30 min。将电泳好的凝胶放到紫外投射仪 或凝胶成像系统上观察结果。 5.9 结果判定 阳性对照扩增到821 bp条带，同时阴性对照未扩增到条带时，试验成立，如果样品亦扩增到821 bp 条带，则确认为副猪嗜血杆菌PCR阳性。 6 间接血凝试验（IHA） 6.1 试剂和材料 6.1.1 标准对照品 副猪嗜血杆菌纯化灭活抗原、副猪嗜血杆菌标准阳性血清、副猪嗜血杆菌标准阴性血清。 6.1.2 致敏红细胞 为副猪嗜血杆菌灭活抗原致敏的绵羊红细胞。 6.1.3 稀释剂 含1%健康兔血清pH 7.2 PBS。 6.1.4 96 孔 V 型板 斜面角度为110°。 6.1.5 微量移液器 可调节至25 μL。 6.1.6 微量振荡器 4 DB22/T 1606—2012 振动频率不大于2000 r/min。 6.2 操作方法 6.2.1 血清的处理 被检血清0.2 mL于无菌小试管中，56 ℃水浴30 min灭活，冷却后加入0.3 mL 2%戊二醛红细胞悬液， 摇匀，置37 ℃水浴3 min，离心后吸出血清供检验用。阳性血清、阴性血清的处理同被检血清。 6.2.2 间接血凝试验（IHA） 用微量移液器先向反应板每孔中加25 μL稀释剂，再向第1孔加人25 μL已处理好的被检血清，充分 混匀后，吸取25 μL加入第2孔，依次做倍比连续稀释至第6孔（血清的稀释倍数为1:2、1:4、1:8、1:16、 1:32、1:64），混匀后从第6孔取出25 μL弃去。向每孔中加入25 μL 2%致敏红细胞，血清的最终稀释 倍数为1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128。同时应设阴、阳性血清对照及致敏红细胞空白对照。置 微型振荡器上震荡30 s后，室温静置2 h，观察结果。 6.3 结果判定 6.3.1 成立条件 致敏红细胞对照无自凝现象，阳性对照血清抗体价 > 1:32；阴性对照血清抗体价 < 1:16时表明试 验成立。 6.3.2 判定标准 本试验的判定标准如下： a) + + + +: 红细胞 100%凝集，在孔底凝集浓缩成团，面积较大； b) + + +: 红细胞 75%凝集，在孔底形成较厚层凝集，面积较大，卷边或呈锯齿状； c) + +: 红细胞 50%凝集，其余不凝集的红细胞在孔底中央集中成较大的圆点；