(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111524630.5 (22)申请日 2021.12.14 (71)申请人 山东大学 地址 266237 山东省青岛市 即墨滨海路72 号 申请人 润辉生物技 术 （威海） 有限公司 (72)发明人 谭海宁　姬胜利　孙凤　唐雯　 李妍　侯慧文　王洁　卢鲁　 符家爱　刘增美　高迪迪　 (74)专利代理 机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 372 21 代理人 王志坤 (51)Int.Cl. A61K 31/4745(2006.01) A61K 47/64(2017.01)A61K 47/61(2017.01) A61K 47/55(2017.01) A61P 37/04(2006.01) A61P 39/06(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 31/04(2006.01) A61P 31/10(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 胆酸-季铵化壳寡糖-ES2肽/喜树碱结合物 的制备方法及应用 (57)摘要 本发明涉及一种胆酸 ‑季铵化壳寡糖 ‑ES2 肽/喜树碱结合物的制备方法及应用， 属于生物 医药技术领域。 本发明通过控制ES2肽、 CA和CPT 的供给量， 反应体系的pH， 反应时间等条件， 可以 制备得到的CQE/CP T结合物。 制备得到的胆酸 ‑季 铵化壳寡糖 ‑ES2肽/喜树碱 结合物与ES2肽相比， 提高了ES2肽的稳定性、 抗新生血管生成与抗肿 瘤活性。 此外， 该结合物还增加了喜树碱的亲水 性， 并可以实现喜树碱的缓慢释放， 从而减少喜 树碱的细胞毒性， 提高肿瘤靶向性， 因此具有更 好的使用效果和应用价 值。 权利要求书2页 说明书6页 附图3页 CN 114306340 A 2022.04.12 CN 114306340 A 1.一种胆酸 ‑季铵化壳寡糖 ‑ES2肽/喜树碱结合物， 其特征在于， 所述胆酸 ‑季铵化壳寡 糖‑ES2肽/喜树碱结合物中， ES2肽、 季铵化壳寡糖(QCOS)、 胆酸(CA)通过酰胺键连接， 将喜 树碱(CPT)包载其中， 所述胆酸 ‑季铵化壳寡糖 ‑ES2肽/喜树碱结合物的结构式如下： (ES2)n1‑QCOS‑(CA)n2/(CPT)n3； 式中， n1＝1～10， n2＝1～10， n3＝1～10。 2.根据权利 要求1所述的胆酸 ‑季铵化壳寡糖 ‑ES2肽/喜树碱结合物， 其特征在于， 季铵 化壳寡糖的分子量小于3000Da， 优选的， 所述季铵化壳寡糖的分子量为2000～3000Da； 所述 季铵化壳寡糖的取代度为 4～7； 优选的， 取代度为 4或5或6； 更优选的， 取代度为5 。 3.根据权利 要求1所述的胆酸 ‑季铵化壳寡糖 ‑ES2肽/喜树碱结合物， 其特征在于， 所述 ES2肽的氨 基酸序列为： IVRRADRAAVP； 所述n1＝1～5； 优选的， n1为2， 3或4； 所述n2＝1～5； 优 选的， n2为2， 3或4个； 所述 n3＝1～5； 优选的， n3为2， 3或4。 4.一种根据上述权利要求任意一项所述胆酸 ‑季铵化壳寡糖 ‑ES2肽/喜树碱结合物 的 制备方法， 其特征在于， 所述制备方法包括以下步骤： 活化ES2肽的羧基部分， 碱性条件 下加 入季铵化壳寡糖反应得到QE结合物； 将活化后的胆酸与QE结合物偶联得到CQE结合物； 采用 超声‑透析法， 将CQE结合物和喜树碱一起溶于二甲基亚砜中， 在超声均化后置于透析袋中 透析， 收集透析液并进行冷冻干燥， 得到所述胆酸 ‑季铵化壳寡糖 ‑ES2肽/喜树碱结合物； 优 选的， 透析袋为截留分子量10 00Da的透析袋。 5.根据权利 要求4所述的制备方法， 其特征在于， QE结合物的制备方法如 下： 向ES2肽的 水溶液中加入1 ‑乙基‑3(3‑二甲基丙胺)碳二亚胺(EDCI)和N ‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为催 化剂活化ES2肽中的羧基， 活化完成后调节pH至弱碱性， 然后缓慢加入季铵化壳寡糖溶液进 行反应， 反应完成后， 反应产物经 纯化即得QE结合物； 优选的， EDCI和NHS催化剂的质量比为1～3： 0.5～1.5； 优选的， 所述弱碱性 为pH值7～8.0； 优选的， 所述季铵化壳寡糖溶液加入ES2肽水溶液后缓慢搅拌， 反应20～25h后结束反 应； 优选的， 所述纯化采用柱色谱或透析， 具体的， 采用截留分子量为1000Da的透析袋进行 纯化得到QE结合物； 优选的， 所述QE结合物的制备方法如下： 将ES2短肽溶于双蒸水中， 获得ES2溶液， 然后 向其中加 入EDCI和NHS催化剂， 比例为2： 1， 混匀， 于室温条件下缓慢搅拌1h； 用双蒸水溶解 季铵化壳寡糖， 将ES2溶液逐滴加入到季铵化壳寡糖溶液中， 缓慢搅拌反应24h， 反应完成 后， 将反应液转移到截留分子量为 1000Da的透析袋中用双 蒸水透析两天， 除去杂质； 透析完 成后， 收集反应液放入冷冻干燥机中冻干， 获得QE结合物。 6.根据权利要求4所述的制备方法， 其特征在于， 所述CQE结合物的制备方法如下： 向胆 酸的水溶液中加入ED CI和NHS进 行活化后， 缓慢加入 上述QE结合物溶液继续反应， 反应结束 后， 反应产物经 纯化后即得CQE结合物； 优选的， 活化时间为0.8～1.2h； 优选的， 所述加入QE结合物溶 液后室温条件下反应20～ 25h； 优选的， 所述纯化采用柱色谱或透析； 具体的， 采用截留分子量为1000Da的透析袋透析 纯化得到 CQE结合物；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114306340 A 2优选的， 所述CQE结合物的制备方法如 下： 将胆酸溶于无水甲醇中， 获得胆酸溶液， 然后 向其中加 入EDCI和NHS催化剂， 比例为2： 1， 混匀， 于室温条件下缓慢搅拌1h； 用双蒸水溶解 QE结合物， 将QE结合物溶液逐滴加入到胆酸溶液中， 缓慢搅拌反应2 4h， 反应完成后， 将反应 液转移到截留分子量为 1000Da的透析袋中用双 蒸水透析两天， 除去杂质； 透析完成后， 收集 反应液放入冷冻干燥机中冻干， 获得CQE结合物。 7.根据权利 要求4所述的制备方法， 其特征在于， 所述胆酸 ‑季铵化壳寡糖 ‑ES2肽/喜树 碱结合物的制备方法如下： 将 CQE结合物和喜树碱溶于D MSO溶液中， 超声均化后， 透析三天， 透析液经冷冻干燥后即得CQE /CPT结合物； 优选的， 所述超声时间为20mi n～40min； 优选的， 所述透析时间为 48h～96h； 优选的， 所述胆酸 ‑季铵化壳寡糖 ‑ES2肽/喜树碱结合物的制备方法如 下： 将CQE结合物 和喜树碱溶于DMSO中， 超声均化30min后置于截留分子量为1000Da的透析袋中， 用双 蒸水透 析三天， 第一天每隔3h换一次水。 后两天每隔6h换一次水； 透析完成后， 用0.45 μm滤膜除去 反应液中的沉淀。 收集透明溶液， 放入冷冻干燥机中冻干， 获得胆酸 ‑季铵化壳寡糖 ‑ES2肽/ 喜树碱结合物。 8.一种药物组合物， 其特征在于， 其包含权利要求1 ‑3任意一项所述胆酸 ‑季铵化壳寡 糖‑ES2肽/喜树碱结合物。 9.根据权利要求8所述的药物 组合物， 其特征在于， 所述药物组合物还包含其他抗肿瘤 活性成分； 所述药物组合物还 含有辅料； 所述药物组合物为固体制剂或液体制剂； 优选的， 所述其他抗肿瘤活性成分选自细胞毒类药物、 激素类药物、 生物反应调节剂、 单克隆抗体药物； 优选的， 所述固体制剂包为片 剂、 胶囊剂、 颗粒剂、 粉剂中的一种； 优选的， 所述液体制剂包括糖浆剂、 注射剂中的一种； 优选的， 所述药物组合物为固体口服制剂、 液体口服制剂或注射剂； 优选的， 所述剂型为可注射 埋植剂、 乳剂、 脂质体、 微囊剂、 微球剂、 纳米粒中的一种。 10.根据权利 要求1‑3任一项所述胆酸 ‑季铵化壳寡糖 ‑ES2肽/喜树碱结合物、 或权利要 求8‑9任一项所述药物组合物在制备增强机体免疫力、 抗氧化、 抗炎、 抗菌、 抗新生血管生成 和/或抗肿瘤的产品中的应用； 优选的， 所述产品包括药物、 保健品或功能性食品。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114306340 A 3