(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111579470.4 (22)申请日 2021.12.2 2 (71)申请人 温州医科 大学 地址 325000 浙江省温州市瓯海区经济开 发区东方南路38号温州市国家大学科 技园孵化器 (72)发明人 吴志刚　姜程曦　张丽萍　费璇　 余佳兴　 (74)专利代理 机构 温州名创知识产权代理有限 公司 33258 专利代理师 朱海晓 (51)Int.Cl. C07K 14/42(2006.01) C07K 1/14(2006.01) C07K 1/30(2006.01)C07K 1/18(2006.01) C07K 1/16(2006.01) C07K 1/36(2006.01) A61K 38/16(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 温郁金凝集素高纯品、 制备方法及应用 (57)摘要 本发明提供温郁金凝集素高纯品的制备方 法及应用， 其特征在于具有以下步骤， ①样品处 理： 温郁金根茎鲜品去皮、 粉碎， Tris ‑HCl缓冲液 低温浸提； ②粗品制备： 固体硫酸铵沉淀， 透析； ③半成品制备： 粗品使用纤维素阴离子交换色谱 DEAE‑52柱分离 纯化；④纯品制备： 半成 品使用葡 聚糖凝胶色谱Sephadex  G‑75柱分离纯化， 得温 郁金高纯品凝集素WLT。 本发明制备的温郁金纯 品凝集素分子量约为28  KDa， 属甘露糖结合型的 天然蛋白， 具有广谱抗肿瘤活性。 因而， 本发明制 备的凝集素产品可作为抗肿瘤药物研发的新药 源， 有利于加速新颖性天然蛋白药物的开发。 权利要求书1页 说明书5页 附图5页 CN 115304663 A 2022.11.08 CN 115304663 A 1.温郁金凝集素高纯品的制备 方法， 其特征在于： 包括以下步骤： S1: 样品处理： 将新鲜的温郁金根茎洗净、 去皮、 粉碎， 加入Tris ‑HCl缓冲液， 浸提12~ 16 h， 离心， 收集上清液； S2: 粗品制备： 在步骤S1得到的上清液中加入固体硫酸铵并充分搅拌至饱和度为60~ 70%， 静置10~12 h， 离心， 沉淀物Tirs ‑HCl缓冲液溶解， 透析， 冷冻干燥得温郁金凝集素粗 品； S3: 半成品制备： 将步骤S2得到的温郁金凝集素粗品加入Tris ‑HCl缓冲液溶解， 用 DEAE‑52纤维素阴离子交换柱分离 纯化， 使用含0.2~1.0 mol/l NaCl的Tri s‑HCl 缓冲液梯 度洗脱， 合并收集具凝血活性的蛋白峰， 冷冻干燥得温郁金凝集素半成品； S4: 高纯品制 备： 将步骤S3得到的温郁金凝集素半成品加入Tris ‑HCl缓冲液溶解， 用 葡聚糖凝胶Sepha dex G‑75柱分离 纯化， 使用含0.2~1.0 mol/l NaCl的Tri s‑HCl 缓冲液梯 度洗脱并收集具凝血活性蛋白峰的试 管液， 合并， 冷冻干燥得温郁金凝集素高纯品。 2. 根据权利要求1所述的温郁金凝集素高纯品的制备方法，  其特征在于： 步骤S1中浸 提及步骤S2中静置均于4~6 ℃进行。 3. 根据权利要求1所述的温郁金凝集素高纯品的制备方法，  其特征在于： 步骤S1中的 粉碎物质量与缓冲液体积的料 液比1： 4~6。 4. 根据权利要求1所述的温郁金凝集素高纯品的制备方法，  其特征在于： 步骤S3中凝 集素粗品和步骤S4中的半成品均使用重量/体积为1： 8~15的料液比的Tr is‑HCl缓冲液进行 溶解。 5. 根据权利 要求1所述的温郁金凝集素高纯品的制备方法，  其特征在于： 步骤S3和S4 中梯度洗脱过程中， 包含采用紫外分光光度计实时监测流出液280  nm处的吸光值的步骤， 以此确定 洗脱液的蛋白峰， 直至流出 液吸光值趋于正常值 为止。 6. 根据权利 要求1所述的温郁金凝集素高纯品的制备方法，  其特征在于： 步骤S1和S2 中离心的具体参数如下： 温度4~6 ℃， 转速5000 ~8000 rpm， 离心时间10~15 min。 7. 根据权利要求1所述的温郁金凝集素高纯品的制备方法，  其特征在于： 所述Tris ‑ HCl 缓冲液浓度为10~12 mM， pH=7~9。 8.如权利要求1 ‑7任一项所述的制备 方法制备 得到的温郁金凝集素高纯品。 9.如权利要求8所述的温郁金凝集素高纯品用于制备抗肿瘤药物的应用。 10.一种抗肿瘤药物， 其特 征在于： 其包 含如权利要求8所述的温郁金凝集素高纯品。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115304663 A 2温郁金凝集素高纯品、 制备方 法及应用 技术领域 [0001]本发明属于生物医药技术领域， 具体涉及一种温郁金凝集素高纯品、 制 备方法及 应用。 背景技术 [0002]温郁金Curcuma wenyujin  Y.H.Chen  & C.Ling系姜科姜黄属植物， 是浙江省道 地 药材， 其地下根茎、 块根采用不同加工方式可制成莪术、 片姜黄和郁金等三种中药。 现代研 究表明从温郁金根茎提取的挥发油 （莪术油） 含有蓬莪术二烯、 莪术醇、 郁金二醇、 莪术烯、 δ‑榄香烯、 β ‑榄香烯等萜类成分， 具有抗病毒、 抗炎、 镇痛、 抗肿瘤等疗效。 然而， 温郁金中萜 类有效含量低， 拓展温郁金新药源是今后发展趋势。 [0003]植物凝集素是一类非免疫原性蛋白， 蛋白分子表面含有众多糖特异结合的位点。 最近研究发现， 植物凝集素可以特异性结合癌细胞膜表面的糖分子， 从而导致癌细胞凋亡 或抑制肿瘤的生长， 是药物设计开发和医学应用的新领域。 我们 前期通过高通量基因组测 序发现， 温郁金根茎中含有 大量编码凝集素蛋白的基因， 其表达量很高， 暗示温郁金根茎含 有丰富的植物源凝集素蛋白。 因此， 提取制备高纯度的温郁金凝集素产品具有广阔的应用 前景。 [0004]中国专利文献 “一种温郁金凝集素粗品、 纯 品、 PGRP菌株混合物的制备方法及温郁 金肥料”（专利号： CN  109553672A） 公开了一种温郁金凝集素的提取方法， 包括： 打浆、 酶解、 硫酸铵沉淀、 透析等步骤， 所得产品为凝集素粗品， 该技术产品主要应用于植物地下根茎促 生细菌菌株 （PGRP） 的结合， 从而制备生物肥料。 上述专利实施过程中采用了丙酮、 石油醚等 有机溶剂， 技 术产品也达不到直接作为 生物药物开发新药源的需求。 发明内容 [0005]本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足， 而提供一种温郁金凝集素 高纯品、 制备 方法及应用。 [0006]本发明所采取的技 术方案如下： 温郁金凝集素高纯品的制备 方法， 包括以下步骤： S1: 样品处理： 将 新鲜的温郁金根茎洗净、 去皮、 粉碎， 加入Tris ‑HCl缓冲液， 浸提 12~16 h， 离心， 收集上清液； S2: 粗品制备： 在步骤S1得到的上清 液中加入固体硫酸铵并充 分搅拌至饱和度为 60~70%， 静置10~12 h， 离心， 沉淀物Tirs ‑HCl缓冲液溶解， 透析， 冷冻干燥得温郁金凝集素 粗品； S3: 半成品制备： 将步骤S2得到的温郁金凝集素粗品加入Tris ‑HCl缓冲液溶解， 用DEAE‑52纤维素阴离子交换柱分离 纯化， 使用含0.2~1.0 mol/l NaCl的Tris ‑HCl 缓冲液 梯度洗脱， 合并收集具凝血活性的蛋白峰， 冷冻干燥得温郁金凝集素半成品； S4: 高纯品制备： 将步骤S3得到的温郁金凝集素半成品加入Tris ‑HCl缓冲液溶 解， 用葡聚糖凝胶Sephadex  G‑75柱分离纯化， 使用含0.2~1.0 mol/l NaCl的Tris ‑HCl 缓说　明　书 1/5 页 3 CN 115304663 A 3