(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111554199.9 (22)申请日 2021.12.17 (71)申请人 华南理工大 学 地址 510641 广东省广州市天河区五山路 381号 (72)发明人 张元　林贵斌　 (74)专利代理 机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 4 4205 代理人 林德强 (51)Int.Cl. C12N 15/40(2006.01) C12N 15/41(2006.01) C12N 15/43(2006.01) C12N 15/45(2006.01) C12N 15/86(2006.01)A61K 48/00(2006.01) A61K 47/26(2006.01) A61K 45/06(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 31/00(2006.01) A61P 37/02(2006.01) A61P 43/00(2006.01) A61P 9/00(2006.01) (54)发明名称 提高基因表达的RNA复制子及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种提高基因表达的RNA复制 子及其应用， 所述RNA复制子包括： 5 ’和3’非翻译 区； 非结构蛋白基因编码区、 亚基因组启动子、 目 的基因编码区。 本发明通过PCR定点突变技术引 入的非结构蛋白区域突变体可复制型RNA， 通过 Lipofectamine2000或者纳米 粒转染至哺乳动物 真核生物细胞， 可显著增强其下游 亚基因组启动 子介导的包括GM ‑CSF、 IFN‑γ、 IL‑2、 IL‑12、 IL‑ 15在内的细胞因子、 趋化因子表达， 可以应用于 肿瘤、 传染性疾病、 自身免疫 性疾病、 遗传性疾病 或心血管疾病的治 疗。 权利要求书2页 说明书13页 序列表13页 附图7页 CN 114317563 A 2022.04.12 CN 114317563 A 1.一种RNA复制子， 按5 ’ ‑3’方向， 所述RNA复制子包括： 5 ’和3’非翻译区； 非结构蛋白基 因编码区、 亚基因组启动子、 目的基因编码区； 其非结构蛋白基因编码区发生(I)～(III)任 意一种突变： (I)选自非结构蛋白1的G357、 G1569、 A1572、 C1575和非结构蛋白2的T3922位点中的至 少一个位 点的突变； 优选为同时突变； (II)选自非结构蛋白1的G357、 G1569、 A1572、 C1575和非结构蛋白2的A3821、 T3922位点 中的至少一个位 点的突变； 优选为同时突变； (III)包括但不限于非结构蛋白2的G3892和非结构蛋白3的A4714位点中的至少一个位 点的突变； 优选为同时突变。 2.根据权利 要求1所述的RNA复制子， 其特征在于， 所述5 ’和3’非翻译区、 非结构蛋白基 因编码区和亚基因 组启动子来源于甲病毒、 黄病毒、 小RNA病毒、 副粘病毒或杯状病毒； 优选地， 所述甲病毒为委内瑞拉马脑炎病 毒、 辛德比斯病毒或塞姆利基森林病毒； 所述 黄病毒为登革热病毒或昆津病毒； 所述小RNA病毒为脊髓灰质炎病毒或人鼻病毒； 所述副粘 病毒为犬痘 热病毒； 所述杯状病毒为猫杯状病毒； 更优选地， 所述甲病毒为委内瑞拉马脑炎病毒。 3.根据权利要求1所述的RNA复制子， 其特征在于， 所述目的基因包括肿瘤特异性或相 关抗原、 病原体特异性或相关抗原、 细胞因子或其受体、 趋化因子或其受体、 生长因子或其 受体、 抗体蛋白、 双特异性抗体蛋白、 细胞 因子抗体融合蛋白和免疫检查点相关蛋白中的至 少一种； 优选地， 所述细胞因子为GM ‑CSF、 IFN‑γ、 IL‑2、 IL‑12或IL‑15。 4.根据权利要求1所述的RNA复制子， 其特 征在于， 所述 突变的方法为PCR定点 突变； 优选地， 所述PCR定点 突变的引物包括： G357C F： 5’ ‑GAAAATGAAGGAGCTCGC CGCCGTCATGAGCGAC CC‑3’； G357C R： 5’ ‑GCTCATGACG GCGGCGAGCTC CTTCATTTTCTTGTCC‑3’； G1569A/A1572C /C1575T F： 5’ ‑GGAGCCCACTCTGGAAGCCGATGTCGACT TGATGTTACAAGAGG‑3’； G1569A/A1572C /C1575T R： 5’ ‑TAACATCAAGTCGACATCG GCTTCCAGAGTGGGCTCCTCAACATC‑3’； A3821T F: 5’ ‑CATTGGTGCTATAGCGCG GCTGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAAC‑3’； T7VEESmaI R:5’ ‑GCTTAAGTTAGTTGCGGCCGCCCGGGTCGACTCTAG ‑3’； T3922C F： 5’ ‑GCCCGTACGCACA ATCCTTACAAGCTTTCATCAAC‑3’； T3922C R： 5’ ‑TGAAAGCTTGTAAGGATTGTGCGTACG GGCCTTG‑3’； G3892C F 5’ ‑CTGTTTGTATTCATTCGGTACGATCGCA AGGCCCGTAC‑3’； G3892C R 5’ ‑CCTTGCGATCGTAC CGAATGAATACAAACAGAACTTC‑3’； A4714G F 5’ ‑TATATCCTCGGAGAAGGCATGAGCAGTAT TAGGTCG‑3’； A4714G R 5’ ‑TAATACTGCTCATGC CTTCTCCGAGGATATACATGC ‑3’。 5.一种载体， 包 含权利要求1～4任一项所述RNA复制子 。 6.一种细胞， 包 含权利要求5所述载体。 7.权利要求1～4任一项所述RNA复制子在(I)～(V)任一项中的应用：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114317563 A 2(I)递送目的基因； (II)实现目的基因的长效表达； (III)提高目的基因的表达量； (IV)基因治疗； (V)疫苗研发。 8.一种组合物， 包 含权利要求1～4任一项所述RNA复制子或权利要求5所述载体。 9.根据权利要求8所述的组合物， 其特征在于， 所述组合物还包含药用稀释剂、 药用赋 形剂、 药用载体和药用载剂中的至少一种； 优选地， 所述组合物中还 可包含其他药物联合使 用， 所述药物包括但 不限于： 单克隆抗体药物、 双特异 性抗体药物、 抗体偶联药物、 融合蛋白 药物、 核酸类药物、 化学 药物、 血液制品药物、 脂类药物或中药提取物； 优选地， 所述药用载体为基于阳离子脂质的市售转染试剂、 非病毒载体、 高分子膜、 仿 生膜、 生物 膜或病毒载体； 所述转染试剂包括但不限于Lipofectamine2000、 Lipofectamine3000、 Lipofectamine8000、 Lipofectamine  LTX、 Lipofectamine  RNAiMAX、 Lipofectamine   MessengerMAX或I nvivofectami ne 3.0； 所述非病毒载体包括但不限于阳离子聚合物、 阳离子脂质体、 阴离子脂质体、 胶束、 无 机纳米颗粒或微球； 所述高分子膜、 仿生膜或生物膜， 包括但不限于细胞膜、 外泌体或细胞外囊泡； 所述病 毒载体， 包括但不限于腺病毒载体、 逆转录病毒、 慢病毒、 疱疹病毒或病毒样颗粒； 优选地， 所述纳米载体包括但不限于多聚阳离子肽、 阳离子脂质、 阴离子脂质、 中性脂 质、 辅助脂质或两亲性 化合物； 优选地， 所述纳米载体的粒径为20～3 50nm， 电荷为 ‑40～50mV。 10.一种用于在生物体表达目的基因的方法， 其包含以下步骤： 向所述生物体中施用权 利要求1～4任一项所述的RNA复制子或权利要求5所述的载体； 优选地， 所述生物体为原核 生物或真核生物。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114317563 A 3