(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111501482.5 (22)申请日 2021.12.09 (71)申请人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 (72)发明人 隋梅花　陈宇　陆欢　李晨　吴昊　 (74)专利代理 机构 杭州君锐知产专利代理事务 所(普通合伙) 33443 专利代理师 黄欢娣 (51)Int.Cl. C12N 5/0783(2010.01) C12Q 1/6811(2018.01) C12Q 1/6888(2018.01) G16B 50/00(2019.01) G16B 40/00(2019.01)A61K 31/713(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 抗血液肿瘤药物活性成分的获得方法及其 用途 (57)摘要 本发明公开了治疗/预防血液肿瘤药物活性 成分的获得方法。 该方法中， 首次对NK ‑92细胞、 NK‑92MI细胞分泌 的细胞外囊泡进行三级分离， 获得两组包括大中小三种尺寸的细胞外囊泡 (Extracellular  Vesicles， EVs)； 然后利用NK ‑ 92细胞、 NK ‑92MI细胞 的微小RNA(miRNA)序列和 两组细胞外囊泡的miRNA序列组成的大样本进行 活性筛选， 获得对血液肿瘤细胞杀伤力强的活性 miRNA。 通过本发明获得的活性 miRNA可参与调节 基因的表达， 具有治疗/预防血液肿瘤的作用； 这 些活性miRNA可能调节免疫细胞的早期发育， 影 响免疫细胞发育及分化； 活性miRNA可能参与免 疫功能的调控， 对血液肿瘤具有治疗/预防作用。 本发明提出的活性 miRNA在脂质体中的转染 效率 高， 转染后的抗肿瘤效果显著。 权利要求书1页 说明书10页 序列表2页 附图5页 CN 114836379 A 2022.08.02 CN 114836379 A 1.一种用于治疗/预防血 液肿瘤药物的活性成分的获得 方法， 其特 征在于， 包括： 1)将以下8组miRNA进行差异表达分析， 筛选出表达量高且差异显著的miRNA； 8组miRNA 为： NK‑92细胞表达的miRNA、 NK ‑92MI细胞表达的miRNA、 NK ‑92细胞外囊泡LEV(Large   Extracellul ar Vesicle)表达的miRNA、 NK ‑92细胞外囊泡EXO(Exosome)表达的miRNA、 NK ‑ 92细胞外囊泡SEV(S mall Extracellular  Vesicle)表达的miRNA、 NK ‑92MI细胞外囊泡LEV 表达的miRNA、 NK ‑92MI细胞外囊泡EXO表达的miRNA、 NK ‑92MI细胞外囊泡SEV 表达的miRNA； 2)将步骤1筛选出的miRNA， 基于差异倍数或平均表达量的高低进行排序， 筛选出差异 倍数高或平均表达量高的活性miRNA ‑X。 2.根据权利要求1所得的方法， 其特征在于， 所述NK ‑92/NK‑92MI细胞外囊泡LEV、 SEV与 EXO通过如下 方法获得： (1)将NK‑92/NK‑92MI细胞培养24 ‑48h后的培养液收集到50mL离心管中， 离心， 去除死 细胞和细胞碎片， 收集上清液。 (2)将第(1)步收集的上清液， 在4℃条件下以离心力10000g离心30min， 获得沉淀为 LEV， 并收集上清液。 (3)将第(2)步得到的上清液转移至超离管中， 在4℃条件下以离心力110000g离心 70min， 获得沉淀 EXO， 并收集上清液。 (4)将第(3)步得到上清液在4℃条件下以离心力16720 0g离心16 h， 获得沉淀SEV。 3.一种用于治疗/预防血液肿瘤药物的活性成分， 其特征在于， 所述的活性成分至少选 自以下之一： (a)序列如SEQ  ID NO.1～SEQ  ID NO.6任一项所示的miR ‑X， 或经修饰的miR ‑X衍生物； (b)前体miRNA， 所述的前体miRNA能在 宿主内加工成(a)中所述的miR ‑X； (c)多核苷酸， 所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA， 并加工形成 (a)中所述的miRNA； (d)表达载体， 所述表达载体含有(a)中所述的miR ‑X的miRNA、 或(b)中所述的前体 miRNA、 或(c)中所述的多 核苷酸； (e)所述(a)中所述的miRNA的激动剂。 4.如权利要求3所述的活性成分， 其特征在于， (e)中所述激动剂选自下组： 促进miR ‑X 表达的物质、 提高miR ‑X活性的物质。 5.如权利要求3所述的活性成分的用途， 所述的活性成分用于制备一药物， 所述药物用 于治疗/预防血 液肿瘤。 6.一种药物组合物， 其特征在于， 所述的药物组合物含有权利要求3所述的活性成分， 和药学上可接受的溶媒或者载体。 7.根据权利要求6所述的组合物， 其特征在于， 所述的药物组合物的制 剂形式为冻干粉 针、 微针、 注射剂、 片 剂、 贴剂、 胶囊、 口服混悬 液或介入栓塞用微球等。 8.根据权利要求6所述的组合物， 其特征在于， 所述药物组合物的递送方法有： 转载法、 装载药物法、 直接裸RNA注射法、 脂质体包裹RNA直接注射法和纳米材料组装法等阳离子材 料复合物递送法， 以及 细菌携带质粒表达RNA法、 病毒包 装表达RNA法等 递送方式。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114836379 A 2抗血液肿瘤药物活性成分的获得方 法及其用途 技术领域 [0001]本发明属于医药技术领域， 涉及相关的活性成分在制 备治疗/预防白血病药物上 的用途。 背景技术 [0002]血液系统恶性肿瘤(Hematological  Malignant  Tumors)是一种血液系统恶性疾 病， 具有高度恶性和分化障碍等特点， 包括急、 慢性白血病及淋巴瘤等。 慢性粒细胞白血病 (Chronic Myelocytic  Leukemia， CML)是一种发生在多能造血干细胞上的恶性骨髓增殖性 肿瘤。 其特点是产生大量不 成熟的白细胞， 这些白细胞在骨髓内聚集， 抑制骨髓正常造血功 能， 并能够通过血液在 全身扩散， 导致病人出现贫血、 容易出血、 感染及器官浸润等。 目前白 血病的治疗方法主要包括化疗、 局部放疗、 靶向治疗、 中药治疗和骨髓移植等， 然而存在药 物治疗效果欠佳、 骨髓移植费用昂贵、 容易产生耐药及 复发等棘手 问题。 因此， 临床上亟需 能够有效治疗/预防血 液肿瘤/白血病的新型活性成分和新型 药物。 [0003]自然杀伤细胞(Natural  Killer cells， NK细胞)来源于骨髓淋巴样干细胞， 主要 分布于骨髓、 外周血、 肝、 脾、 肺和淋巴结等组织器官中。 NK细胞不同于T细胞和B细胞， 是一 类无需预先致敏就能非特异 性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞。 NK ‑92是生长、 增 殖依赖于IL ‑2的人源性NK细胞株， NK ‑92MI是源自NK ‑92细胞株、 经基因转染得到的IL ‑2非 依赖性NK细胞株。 两株人源性NK细胞株可以方便和经济地实现稳定、 大量、 长期扩增， 并已 被证实对很多恶性肿瘤具有细胞毒 性。 细胞外囊泡(Extracellular  Vesicles， EVs)是由细 胞释放的各种具有膜结构的囊泡的统称 。 科学家们最早于198 3年从绵羊网织红细胞中分离 出携带亲本细胞成分的细胞外囊泡， 其后细胞外囊泡 陆续在血液、 尿液、 羊水、 唾液等体液 中被发现和报道。 细胞外囊泡通常携带母细胞内的重要生物活性物质， 例如蛋白质 、 mRNA、 miRNA和脂质等， 能够通过与靶细胞的结合而调控细胞功能， 参与细胞间交流。 [0004]本发明利用两种 人源性NK细胞株NK ‑92和NK‑92MI作为获取NK细胞分泌的细胞外 囊泡的来源。 发明内容 [0005]鉴于上述背景技术， 本发明的目的是提供一种活性成分的获得方法及 其在制备治 疗/预防白血病药物上的用途。 [0006]经研究， 本发明提供如下技术方案： 一种用于制 备抗血液肿瘤药物的活性成分的 获得方法， 包括： [0007]1)将以下8组miRNA进行差异表达分析， 筛选出差异倍数显著或平均表达量高的 miRNA； 8组miRNA为： NK ‑92表达的miRNA、 NK ‑92MI表达的miRNA、 NK ‑92细胞外囊泡LEV表达的 miRNA、 NK ‑92细胞外囊泡SEV表达的miRNA、 NK ‑92细胞外囊泡EXO表 达的miRNA、 NK ‑92MI细胞 外囊泡LEV表达的miRNA、 NK ‑92MI细胞外囊泡SEV表达的miRNA、 NK ‑92MI细胞外囊泡E XO表达 的miRNA。说　明　书 1/10 页 3 CN 114836379 A 3