(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202110905777.2 (22)申请日 2021.08.0 6 (71)申请人 广东工业大 学 地址 510006 广东省广州市东 风东路729号 (72)发明人 王华倩　何贤樱　纪美琪　 (51)Int.Cl. A61K 39/00(2006.01) A61K 39/385(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C07K 19/00(2006.01) C12N 15/70(2006.01) (54)发明名称 一种靶向树突状细胞的肿瘤抗原肽疫苗的 制备及应用 (57)摘要 本发明涉及一种肿瘤抗原肽疫苗， 具体涉及 免疫细胞靶向的肿瘤抗原肽 疫苗的制备及应用。 本发明用霍乱毒素A或B亚基荷载肿瘤抗原肽， 其 中霍乱毒素A1结构域用促进树突状细胞成熟的 细胞因子序列取代， 经菌株诱导表达， 变复性， 纯 化， 体外酸碱嵌合后得到重组霍乱毒素样嵌合蛋 白。 所述免疫细胞靶向的肿瘤抗原肽疫苗的制备 方法， 得到的所述免疫细胞靶向的肿瘤抗原肽疫 苗能够靶向树突状细胞的GM1受体， 增加树突状 细胞对肿瘤抗原肽的摄取处理， 增加肿瘤抗原肽 和主要组织相容性复合体I类的结合， 促进交叉 呈递， 有效激活细胞毒性T淋巴细胞， 解决了现有 肿瘤抗原DC疫苗的体外培养费用高， 操作复杂， 难以推广及肿瘤抗原肽免疫原性低的问题。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图5页 CN 114042151 A 2022.02.15 CN 114042151 A 1.一种靶向树 突状细胞的肿瘤抗原肽疫苗的制备及应用， 其特 征在于， 包括： (1)霍乱毒素A亚基或B亚基的C末端共价结合肿瘤抗原肽， 其中霍乱毒素A1结构域用促 进树突状细胞成熟的细胞因子序列取代； (2)荷载肿瘤抗原肽的霍乱毒素A亚基或B亚基经纯化后在体外通过酸碱嵌合形成重组 霍乱毒素样嵌合蛋白； (3)重组霍乱毒素样嵌合蛋白能够靶向免疫细胞， 被免疫细胞所摄取处理， 促进交叉呈 递。 2.根据权利要求1所述的一种靶向树突状细胞的肿瘤抗原肽疫苗的制备及应用， 其特 征在于， 所述步骤(1)中， 霍乱毒 素A亚基的C末端共价结合肿瘤抗原肽氨基酸序列如S EQ ID  No.1所示。 3.根据权利要求1所述的一种靶向树突状细胞的肿瘤抗原肽疫苗的制备及应用， 其特 征在于， 所述步骤(1)中， 霍乱毒 素B亚基的C末端共价结合肿瘤抗原肽氨基酸序列如S EQ ID  No.2所示。 4.根据权利要求1所述的一种靶向树突状细胞的肿瘤抗原肽疫苗的制备及应用， 其特 征在于， 所述步骤(1)中， 肿瘤抗原肽为主要组织相容性复合体I类限制性的卵清白蛋白多 肽257‑264(OVA257‑264)， 其氨基酸序列如SEQ  ID No.3所示。 5.根据权利要求1所述的一种靶向树突状细胞的肿瘤抗原肽疫苗的制备及应用， 其特 征在于， 所述步骤(2)中， 所述荷载肿瘤抗原肽的霍乱毒 素A亚基或B亚基应与未荷载肿瘤抗 原肽的霍乱毒素B亚基或A亚基 体外酸碱嵌合， 形成重组霍乱毒素样嵌合蛋白。 6.根据权利要求1所述的一种靶向树突状细胞的肿瘤抗原肽疫苗的制备及应用， 其特 征在于， 所述步骤(3)中， 所得肿 瘤抗原肽疫苗即重组霍乱毒素样嵌合蛋白能够通过GM1靶 点靶向树 突状细胞。 7.根据权利要求1所述的一种靶向树突状细胞的肿瘤抗原肽疫苗的制备及应用， 其特 征在于， 所述步骤(3)中， 所得肿瘤抗原肽 疫苗即重组霍乱毒 素样嵌合蛋白能够直接在体外 促进骨髓来源的树 突状细胞增殖， 成熟。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114042151 A 2一种靶向树突状细胞的肿瘤抗原肽疫苗的制备及应用 技术领域 [0001]本发明涉及一种肿瘤抗原肽疫苗， 特别涉及免疫细胞靶向的肿瘤抗原肽疫苗。 背景技术 [0002]肿瘤抗原疫苗是肿瘤免疫疗法中的一个研究热点， 其中利用肿瘤抗原肽即只包含 肿瘤细胞 中引起免疫应答所必需的抗原部 分使得疫苗更有 特异性。 在体内， 肿瘤抗原肽有 两条途径可  以走， 一条为抗原肽结合主要组织相容性复合物II类(MHCII)， 进而激活CD4 +T 细胞； 另 一条为抗原肽呈递给主要组织相容性复合物 I类(MHCI)进而激活CD8+T细胞为CTL (细胞 毒性T淋巴细胞)， CTL则能够攻击肿瘤细胞， 达到杀伤体内肿瘤， 治疗癌症的效果， 同 时肿 瘤细胞的裂解也会释放肿瘤抗原， 为患者提供肿瘤抗原的刺激， 因此我们更关注于 CD8+T细 胞激活途径， 这条途径被称为交叉呈递。 当肿瘤抗原肽疫苗注入体内后， 抗原肽被 抗原呈递  细胞(APC)， 如巨噬细胞， B细胞， 树突状细胞所呈递处理。 其中树突状细胞(DC)是 目前 认为功能最强大的APC。 因此， 当肿瘤抗原肽疫苗进入体内后能够靶向DC则能大大增 强外源 性肿瘤抗原肽交叉 呈递， 激活CTL以杀伤肿瘤 细胞。 [0003]虽然肿瘤抗原DC疫苗能够较有效解决交叉呈递能力差的问题， 但其临床应用由于 DC体外 培养费用高， 操作复杂， 难以推广。 而且肿瘤抗原肽疫苗在体内免疫原 性低， 在还没 激活免 疫系统时就易被降解， 因此需要一种靶向DC的肿瘤抗原肽疫苗以促进更多的抗原 肽递送给 DC， 促进DC的成熟， 增 加交叉呈递。 发明内容 [0004]针对背景技术提出的问题， 本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足， 提供 一种能 够靶向DC的肿瘤抗原肽 疫苗， 以增加肿瘤抗原肽被D C摄取和处理， 并且能够促进D C 成熟， 增加交叉呈递。 [0005]为达此目的， 本发明采用以下技 术方案： [0006]一种能够靶向树 突状细胞的肿瘤抗原肽疫苗的制备及应用， 包括以下步骤： [0007](1)为了构建表达载体pET22b ‑mGM‑CSF‑CTA2‑OVA257‑264， 将OVA257 ‑264基因克 隆 到pET22b ‑mGM‑CSF‑CTA2(实验室保存质粒)载体中， 使用SalI和XhoI限制性位点。  mGM‑ CSF‑CTA2‑OVA257‑264的氨基酸序列如SEQ  ID No.1所示； [0008](2)为了构建表达载体pET28b ‑CTB‑OVA257‑264， 使用NheI和XhoI限制性位点将   OVA257‑264(SIINFEKL)基因克隆到pET28a ‑CTB(实验室保存质粒)中。 CTB ‑OVA257‑264 的 氨基酸序列如SEQ  ID No.2所示； [0009](3)将步骤(1)(2)所 得的表达载体导入大肠杆菌宿主菌中； [0010](4)通过蛋白表达纯化获得目的蛋白mGM ‑CSF‑CTA2‑OVA257‑264， 将蛋白  mGM‑ CSF‑CTA2‑OVA257‑264， CTB(实验室保存蛋白)， 按照 摩尔比1∶ 1混合在一起， 通过酸  碱嵌合 的方法获得重组霍乱毒素样嵌合蛋白m6 M‑CSF‑CTA2‑OVA257‑264/CTB； [0011](5)通过蛋白表达纯化获得目的蛋白CTB ‑OVA257‑264， 按照步骤(4)获得重组霍乱说　明　书 1/8 页 3 CN 114042151 A 3