(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202110744676.1 (22)申请日 2021.06.30 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113501879 A (43)申请公布日 2021.10.15 (73)专利权人 拜盖特生物科技 （上海） 有限公司 地址 201109 上海市闵行区虹梅 南路4999 弄21号楼二层I室 (72)发明人 姜钰超　程硕　 (74)专利代理 机构 上海申新 律师事务所 31272 专利代理师 郎祺 (51)Int.Cl. C07K 16/46(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/85(2006.01)C12N 5/10(2006.01) C12N 7/01(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61K 35/768(2015.01) A61P 35/00(2006.01) 审查员 周洁 (54)发明名称 一种解除肿瘤免疫微环境中免疫抑制的双 功能抗体及其应用和制备方法 (57)摘要 本发明提供了一种解除肿瘤免疫微环境中 免疫抑制的双功能抗体及其应用和制备方法。 该 双功能抗体为PD ‑L1抗体可变区和TGF ‑βs抗体 可变区组合形成的二硫键稳定的双功能scDb ‑ CH3结构， 包括PD ‑L1抗体可变区、 TGF ‑βs抗体可 变区、 可产生二硫键的人IgG  1的铰链结构域、 人 IgG1的CH3结构域和连接肽。 本发明提供的双功 能抗体设计成二硫键稳定的二价形式以增强对 靶点的亲合力， 具有比IgG类抗体更小的基因， 能 同时阻断PD ‑L1和TGF‑β信号通路， 可以实现低 剂量高药效的效果； 此外， 该双功能抗体选择肿 瘤高表达的PD ‑L1作为靶点， 使得其具有靶向富 集于肿瘤微环境而不阻断非病理生理过程中 TGF‑β信号的作用， 提高了 药物的靶向性和安全 性， 为治疗肿瘤提供 更多高效和安全的选择。 权利要求书1页 说明书17页 序列表16页 附图7页 CN 113501879 B 2022.09.06 CN 113501879 B 1.一种解除肿瘤免疫微环境中免疫抑制的双功能抗体， 其特征在于， 为PD ‑L1抗体可变 区和TGF‑β s抗体可变区组合形成的二硫键稳定的双功能scDb ‑CH3结构bsDHC， 包括PD ‑L1抗 体可变区、 TGF‑β s抗体可变 区、 可产生二硫键的人IgG1 的铰链结构域、 人IgG1 的CH3结构域 和连接肽； 所述PD‑L1抗体可变区包括重链可变区和轻链可变区； 所述重链可变区的氨基酸序列选自SEQ  ID NO:4， 所述轻链可变区的氨基酸序列选自 SEQ ID NO:6； 或， 所述重链可变区的氨基酸序列选自SEQ  ID NO:8， 所述轻链可变区的氨基酸序列选自 SEQ ID NO:10； 或， 所述重链可变区的氨基酸序列选自SEQ  ID NO:12， 所述轻链可变区的氨基酸序列选自 SEQ ID NO:14； 所述TGF‑β s抗体可变区包括TGF ‑β 抗体的重链可变区和TGF ‑β 抗体的轻链可变区； 所述 TGF‑β 抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ  ID NO.30， 所述TGF ‑β 抗体的轻链可变区的氨 基酸序列为SEQ  ID NO.32。 2.根据权利 要求1所述的双功能抗体， 其特征在于， 所述连接肽的氨基酸序列为SEQ  ID  NO.29、 31、 34。 3.根据权利要求1所述的双功能抗体， 其特征在于， 所述人IgG  1的铰链结构域的氨基 酸序列为SEQ  ID NO.33； 所述人IgG1的C H3结构域的氨基酸序列为SEQ  ID NO.35。 4.如权利要求1 ‑3任一项所述双功能抗体的制备方法， 其特征在于， 合成PD ‑L1抗体可 变区、 TGF ‑β s抗体可变区、 可产生二硫键的人IgG  1的铰链结构域、 人IgG1的CH3结构域和连 接肽， 然后通过化学合成的方式合成所述双功能抗体bsDH C。 5.如权利要求1 ‑3任一项所述双功能抗体在制备治疗肿瘤药物中的应用。 6.一种治疗肿瘤的药物， 其特征在于， 包括如权利要求1 ‑3任一项所述双功能抗体， 并 将其作为活性成分。 7.一种表达如权利要求1 ‑3任一项所述双功能抗体的CAR ‑T细胞。 8.根据权利要求7所述的CAR ‑T细胞， 其特征在于， CAR由依次连接的人CD8信号肽、 GC33 单链抗体、 人CD8铰链区、 人CD8跨膜区、 人41BB胞内区、 人CD3ζ 胞内区、 P2A自切割肽、 人IgGκ 信号肽和所述双功能抗体组成。 9.一种含有编码如权利要求1 ‑3任一项所述双功能抗体的核苷酸序列的双功能溶瘤病 毒。 10.一种治疗肿瘤的生物制剂， 其特征在于， 包括如权利要求7 ‑8任一项所述的CAR ‑T细 胞或者如权利要求9所述的双功能溶瘤病毒。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 113501879 B 2一种解除肿瘤免疫 微环境中免疫抑制的双功能抗体及其应用 和制备方 法 技术领域 [0001]本发明涉及 生物医药领域， 具体涉及一种解除肿瘤免疫微环境中免疫抑制的双功 能抗体及其应用和制备 方法。 背景技术 [0002]令人熟知的， 程序性死亡因子1受体(pr ogrammed  cell death‑1， PD‑1)/程序性死 亡受体‑配体1(programmed  cell death‑ligand 1， PD‑L1)免疫抑制信号通道会抑制T细胞 扩增， 降低效应T细胞功能， 引起免疫耐受， 促进T细胞凋亡， 会严重 削弱肿瘤浸润T细胞的肿 瘤杀伤效果。 已有众多已上市 的PD‑1和PD‑L1抗体药物针对广泛的肿瘤适应症均有显著疗 效， 这是生物制药领域的巨大进步， 这也促使业内更加关注解除肿瘤 免疫微环境中免疫抑 制， 恢复“免疫正常化 ”的药物开发。 [0003]在肿瘤发展早期， TGF ‑β s有抑癌作用。 但随着肿瘤发展， TGF ‑β s对肿瘤的促进作用 是多方面的。 首先， TGF ‑β s信号可作用于肿瘤微环境(TME)中的免疫细胞。 一方面， 分泌的 TGF‑β s会抑制效应性T细胞和天然杀伤细胞(NK)的细胞毒性， 这就减弱了TME中固有免疫细 胞的抗肿瘤能力； 另一方面， 调节性T细胞(Tregs)通过在微环境中促进TGF ‑β s的递呈和激 活， 抑制CD8+T细胞的功能； 同时， 激活的TGF ‑β s通过诱导FOXP3的表达， 使初始CD4+T细胞分 化为调节 性T细胞， 从而 形成正反馈， 促进肿瘤逃逸免疫监管。 其次， TGF ‑β s信号可以通过诱 导HMGA2、 Snail1/2等转录因子的表达， 诱发上皮 ‑间质转化(EMT)， 进而逃逸凋亡作用。 EMT 是肿瘤侵袭和迁移的重要病理特征， 也是癌细胞扩散的先决条件。 同时， 微环境中存在的 EGF和PDGF等生长因子， 也会与TGF ‑β s共同作用诱导EMT。 另外， TGF ‑β s表达上调， 也会促进 VEGF‑A等因子的分泌， 刺激新生血管生 成， 从而为癌细胞的生长和转移提供助力。 近期的研 究还表明， TGF ‑β s信号通路还与肿瘤细胞的耐药性相关。 比如， 它可以使肿瘤细胞避开一些 化疗药物的杀伤作用， 它也可以通过上调蛋白激酶Cα表达增强肿瘤细胞的耐药性。 更为重 要的线索是， 于2018年在nature杂志由Daniele  V.f.Tauriello等人发表的TGF ‑β drives  immune evasion in geneticall y reconstituted  colon cancer metastasis以及同年在 nature杂志由Sanjeev  Mariathasan等人发表的TGF ‑β attenuates  tumour response  to  PD‑L1 blockade  by contributing  to exclusion  of T cells共同阐述了肿瘤基质 (tumor stroma)中的TGF ‑β信号是造成免疫豁免(immune  exclusion)的决定因素， 联合 TGF‑β 抑制以及P D‑1/PD‑L1抗体的免疫 治疗在小鼠肿瘤模型中呈现出 更强的响应。 [0004]以往研究显示， TGF ‑β s单药治疗的响应率并不高， 这可能与它不是肿瘤驱动 因素 有关。 此外， 由于TGF ‑β 信号在非病理生理过程中的作用， 系统抑制TGF ‑β 信号传导会伴随不 良事件的发生。 传统的TGF ‑β 信号通路的抗体或小分子药物具有广泛全身性的阻断效果， 对 非肿瘤相关的TGF ‑β信号阻断会影响正常生理学功能而导致的副反应， 如已经开展临床实 验的抗体药物Freso limumab和小分子药物Galun isertib。 [0005]因此， 联合疗法已成为了这个领域主要发展方向之一， 包括与免疫检查点抑制剂说　明　书 1/17 页 3 CN 113501879 B 3