(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202110827960.5 (22)申请日 2021.07.2 2 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113461830 A (43)申请公布日 2021.10.01 (73)专利权人 徐州医科 大学 地址 221004 江苏省徐州市铜山路209号 (72)发明人 李慧忠　王刚　郑骏年　曹培育　 刘宜林　 (74)专利代理 机构 北京预立 生科知识产权代理 有限公司 1 1736 代理人 朱萍　孟祥斌 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/867(2006.01) C12N 5/10(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(2006.01) (56)对比文件 CN 111041064 A,2020.04.21CN 110240658 A,2019.09.17 CN 10976278 8 A,2019.0 5.17 CN 111733186 A,2020.10.02 CN 110272493 A,2019.09.24 CN 112029001 A,2020.12.04 CN 1080473 32 A,2018.0 5.18 CN 108285486 A,2018.07.17 CN 106636155 A,2017.0 5.10 CN 107034237 A,2017.08.1 1 CN 108508200 A,2018.09.07 Ying等.A safe and potent anti- CD19 CAR T cel l therapy. 《Nat Med》 .2019,第25卷 (第6期),第947-95 3页. Jeremy S. Abram son.Anti-CD19 CAR T- Cell Therapy for B- Cell Non-Hodgkin Lymphoma. 《Transfusi on Medici ne Reviews》 .2019,第34卷(第1期),第2 9-33页. 蒙露.通用型CD19_ CAR-T的体 外构建及 初步 功能鉴定. 《中国细胞生物学 学报》 .2021,第43卷 (第2期),第31 1-318页. 审查员 陈盛峰 (54)发明名称 一种脐带血来源的靶向CD19 的CAR-NK细胞 及其制备方法 (57)摘要 本发明提供了一种CAR ‑NK细胞， 所述CAR ‑NK 细胞能够地提高肿瘤细胞的杀伤效率和临床治 疗的安全性、 有效性； 同时， 本发明还提供了 所述 一种CAR‑NK在制备药物中的应用， 从而 提供了一 种具有应用前景的安全、 可靠、 高效肿瘤治疗的 新手段。 权利要求书2页 说明书9页 序列表9页 附图2页 CN 113461830 B 2022.04.26 CN 113461830 B 1.一种由抗CD19的特异性抗体、 铰链区、 跨膜结构域、 共刺激结构域和胞内信号传导结 构域组成的CAR， 其特征在于， 所述抗CD19的特异性抗体包含重链可变区和轻链可变区， 所 述重链可变区的氨基酸序列如SEQ  ID NO:1所示， 所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ  ID  NO:2所示， 所述 抗CD19的特异性 抗体的氨基酸序列如SEQ  ID NO:4所示； 所述铰链区为CD8α铰链区、 所述跨膜结构域为CD8α跨膜结构域、 所述共刺激结构域为 CD137的胞内结构域、 所述胞内信号传导结构域 为CD3ζ 的胞内信号传导结构域； 所述由抗CD19的特异性抗体、 铰链区、 跨膜结构域、 共刺激结构域和胞内信号传导结构 域组成的CAR的氨基酸序列如SEQ  ID NO:5所示。 2.如权利 要求1所述的CAR， 其特征在于， 所述CAR还连接有自我剪切序列和免疫调 节剂 的氨基酸序列。 3.如权利要求2所述的CAR， 其特 征在于， 所述自我剪切序列是2 A肽。 4.如权利要求3所述的CAR， 其特 征在于， 所述2 A肽为T2A。 5.如权利要求 4所述的CAR， 其特 征在于， 所述T2 A的氨基酸序列如SEQ  ID NO:7所示。 6.如权利要求2所述的CAR， 其特 征在于， 所述免疫调节剂是I L‑15。 7.如权利要求6所述的CA R， 其特征在于， 所述免疫调节剂的氨基酸序列如SEQ  ID NO:6 所示。 8.一种CAR ‑NK细胞， 所述CAR ‑NK细胞是表达权利要求1 ‑7任一所述的CAR的NK细胞。 9.一种制备权利要求8所述CAR ‑NK细胞的方法， 其特征在于， 所述方法包括将编码权利 要求1‑7任一所述CAR的核酸分子所在的载体引入NK细胞。 10.如权利要求9所述的方法， 其特征在于， 所述引入的方法包括电穿孔、 脂质体转染、 病毒转染。 11.如权利要求10所述的方法， 其特 征在于， 所述病毒转染使用的是逆转录病毒。 12.如权利要求9所述的方法， 其特征在于， 所述NK细胞包括自行制备的人源NK细胞或 是商品化的NK细胞系。 13.如权利要求12所述的方法， 其特征在于， 所述NK细胞的制备方法包括制备单个核细 胞的步骤、 诱 导NK细胞的步骤、 收集细胞的步骤。 14.如权利要求13所述的方法， 其特征在于， 所述单个核细胞包括外周血单个核细胞和 脐带血单个核细胞。 15.如权利要求13所述的方法， 其特征在于， 所述诱导NK细胞所使用的培养基是NK细胞 诱导培养基。 16.如权利要求15所述的方法， 其特征在于， 所述NK细胞诱导培养基是X ‑VIVO15培养 基。 17.如权利 要求16所述的方法， 其特征在于， 所述X ‑VIVO15培养基中还添加了FBS、 抗生 素、 Glutami ne中的一种或多种。 18.如权利 要求16所述的方法， 其特征在于， 所述NK细胞诱导培养基是X ‑VIVO15培养基 中添加5%  FBS、 1% P/S、 2mM Glutamine中的至少一种。 19.如权利要求13所述的方法， 所述诱导NK细胞还包括将NK细胞诱导培养基重悬的细 胞液在抗体预包被板上培 养。 20.如权利要求19所述的方法， 其特 征在于， 所述 抗体预包被板是CD16抗体预包被板 。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 113461830 B 221.如权利要求19所述的方法， 其特征在于， 所述诱导NK细胞还包括向添加了细胞液的 抗体预包被板的孔中添加活化因子 。 22.如权利要求21所述的方法， 其特 征在于， 所述活化因子包括 4‑1BBL、 OK432、 I L‑2。 23.如权利要求22所述的方法， 其特征在于， 所述活化因子是50ng/mL  4‑1BBL、 0.01KE/ mL OK432、 10 00 U/mL IL‑2的组合。 24.如权利要求15所述的方法， 其特征在于， 向NK细胞诱导培养基的培养基添加IL ‑2 后， 重悬离心收集到的细胞， 并培 养。 25.如权利要求24所述的方法， 其特 征在于， 所述 IL‑2的工作浓度是10 00U/mL。 26.由权利要求1 ‑7任一所述的CAR构成的CAR ‑NK细胞， 或由所述CAR ‑NK细胞组成的组 合物在制备治疗 疾病的药物中的应用， 所述疾病是与B 细胞相关的淋巴瘤和白血病； 所述B细胞相关的淋巴瘤和白血病包括B型急性淋巴细胞性白血病、 非霍奇金淋巴瘤、 B 细胞慢性淋巴细胞性白血病 、 小淋巴细胞性淋巴瘤、 前淋巴细胞性白血病 、 毛细胞白血病。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 113461830 B 3