(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202110827989.3 (22)申请日 2021.07.2 2 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113462646 A (43)申请公布日 2021.10.01 (66)本国优先权数据 202110739295.4 2021.0 6.30 CN (73)专利权人 徐州医科 大学 地址 221004 江苏省徐州市铜山路209号 (72)发明人 李慧忠　郑骏年　王刚　刘宜林　 张连军　 (74)专利代理 机构 北京预立 生科知识产权代理 有限公司 1 1736 专利代理师 朱萍　孟祥斌(51)Int.Cl. C12N 5/0783(2010.01) A61K 35/17(2015.01) A61P 35/00(2006.01) (56)对比文件 CN 110872575 A,2020.0 3.10 审查员 徐俊 (54)发明名称 一种简单有效的诱导扩增iNKT细胞的方法 及应用 (57)摘要 本发明提供了一种诱导扩增iNKT细胞的方 法， 本发明的方法起始需求量小(～ 106数量级)， 获得的iNKT细胞比例高， 7～9天后iNKT细胞比例 从0.01～1 ％提高至2 0～80％， 能显著提高效率， 最终iNKT细胞扩增超过2000倍； 并且制备得到的 细胞能够分泌Th1型细胞因子， 高表达CD62L， 在 体内的存活时间长， 能满足临床治 疗的需求。 权利要求书1页 说明书7页 附图2页 CN 113462646 B 2022.06.24 CN 113462646 B 1.一种诱导iNKT细胞的培养基， 所述诱导iNKT细胞的培养基是向基础 淋巴细胞培养基 中添加细胞激动 剂和细胞因子配制而成， 所述细胞激动剂是α ‑Galcer， 所述细胞因子由IL ‑ 2、 IL‑21、 IL‑4、 GM‑CSF组成， 所述α ‑Galcer的终浓度是 100ng/mL， 所述IL ‑2的终浓度是50U/ mL， 所述IL ‑21的终浓度是10ng/mL， 所述GM ‑CSF的浓度是500U/mL， 所述IL ‑4的终浓度是 500U/mL， 基础淋巴细胞培 养基是含有FCS的X ‑VIVO 15培养基。 2.一种诱导iNKT细胞的方法， 所述方法包括使用权利要求1所述的诱导iNKT细胞的培 养基培养外周血单个核细胞的步骤。 3.如权利要 求2所述的方法， 其特征在于， 所述外周血单个核细胞的初 始浓度为1 ×106/ mL~10×106/mL。 4.如权利要 求3所述的方法， 其特征在于， 所述外周血单个核细胞的初 始浓度为2 ×106/ mL。 5.如权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述外周血单个核细胞从外周血中分离的方 式是Ficoll密度梯度离心法。 6.一种制备i NKT细胞的方法， 所述方法包括以下步骤： 1） 诱导iNKT细胞： 使用权利要求2 ‑5任一所述的诱 导iNKT细胞的方法进行细胞诱 导； 2） 使用磁珠对步骤1） 得到的i NKT细胞进行分选； 3） 活化扩增iNKT细胞： 使用含有IL ‑7和IL‑15的淋巴细胞培养基培养步骤2） 得到的细 胞， 然后将细胞接种到抗体液包被的孔板上培养， 所述抗体液含有CD3单克隆抗体和CD28单 克隆抗体， 所述含有IL ‑7和IL‑15的淋巴细胞培养基是向基础淋巴细胞培养基添加IL ‑7和 IL‑15配制而成的。 7.如权利要求6所述的方法， 所述 IL‑7的终浓度是10ng/mL。 8.如权利要求6所述的方法， 所述 IL‑15的终浓度是5ng/mL。 9.如权利要求6所述的方法， 所述基础淋巴细胞培 养基是含有FCS的X ‑VIVO 15培养基。 10.如权利要求6所述的方法， 其特 征在于， 所述CD3单 克隆抗体的工作浓度是1 μg/mL。 11.如权利要求6所述的方法， 其特 征在于， 所述CD28单 克隆抗体的工作浓度是1 μg/mL。 12.权利要求1所述的诱 导iNKT细胞的培 养基在诱 导iNKT细胞中的用途。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 113462646 B 2一种简单有效的诱导扩增i NKT细胞的方 法及应用 技术领域 [0001]本发明属于细胞 免疫治疗领域， 涉及一种简单有效的诱导扩增iNKT细胞的方法及 应用。 背景技术 [0002]iNKT细胞因其表达独特的invariant  TCR而得名， 其主要识别由CD1d分子呈递的 糖脂抗原， 通过分泌 大量的细胞因子， 同时介导先天性免疫和适应性免疫。 目前iNKT细胞被 认为是一群稀有的但是具有强有力的免疫调节和效应功能的T细胞， 在抗肿瘤 免疫中发挥 重要的功能。 [0003]目前多项研究表明肿瘤患者存在 体内iNKT细胞含量低或功能受损(分泌IFN ‑γ能 力降低)的现象。 肿瘤内浸润的iNKT细胞数量与神经母细胞瘤和结肠癌等的临床预后密切 相关； 一项中位随访时间长达8.7年的研 究报道， 循环iN  KT细胞严重缺乏的头颈鳞癌患者 临床预后差； 造血干细胞移植后外周血中iNK  T细胞的重建有助于儿童白血病的长期缓解 等。 以上发现均提 示iNKT细胞具有有效的抗肿瘤活性， 近年 来iNKT免疫细胞疗法备受关注。 [0004]目前认为 iNKT细胞主 要通过以下机制发挥抗肿瘤作用： [0005]1、 CD1d依赖性直接的细胞毒杀伤活性： 主要由Perforin、 FasL、 GranB、 TNF ‑α 等介 导； [0006]2、 CD1d非依赖性的细胞毒杀伤活性： 一旦活化通过分泌大量的Th1/Th2型细胞因 子同时激活机体的先天免疫及适应性免疫， 其中iNKT与DC细胞间由CD40 ‑CD40L或CD1d脂类 抗原/iTCR介导的 “交叉对话 ”及通过分泌IFN ‑γ活化CD8+T细胞尤为重要， 从而增强抗肿瘤 效果； [0007]3、 免疫调节机制： 最新研究报道在原发性神 经母细胞瘤中， 发现iNKT细胞通过杀 死肿瘤相关巨噬细胞(TAM)来介导抗肿瘤活性； 此外在人和小鼠甲型流感病毒感染的模型 中， 发现iNKT细胞能够降低髓样来源抑制细胞(MDS  C)的免疫抑制活性。 这些发现提示iNKT 细胞存在一种新的作用机制， 即通过杀伤免疫抑制细胞来调节肿瘤微环境， 从而增强抗肿 瘤免疫效应。 [0008]近年来利用 iNKT细胞治疗肿瘤的临床试验陆续开展。 临床数据显示扩增培养的 iNKT细胞过继性免疫治疗肿瘤无明显副作用， 具有良好的临床应用前景。 但是由于人体外 周血中iNKT细胞含量低(约占淋巴细胞的0.01～1％)， 目前扩增方法存在起始细胞需求量 大、 扩增周期 长、 细胞制剂纯度低、 活性弱等技术难题， 最 终导致临床整体缓解率低， 抗肿瘤 效果不理想。 发明内容 [0009]优化的淋巴细胞培 养基 [0010]本发明提供一种优化的淋巴细胞培养基， 所述优化的淋巴细胞培养基是向基础淋 巴细胞培 养基中添加细胞激动剂和细胞因子配制而成。说　明　书 1/7 页 3 CN 113462646 B 3