(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202110766645.6 (22)申请日 2021.07.07 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113493526 A (43)申请公布日 2021.10.12 (73)专利权人 星汉德生物医药 （大连） 有限公司 地址 116051 辽宁省大连市旅顺口区龙头 街道东北山村 (72)发明人 金涛　 (74)专利代理 机构 大连中奥丰汇知识产权代理 事务所(普通 合伙) 21257 专利代理师 朱国芳 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01)C12N 15/85(2006.01) C12N 5/10(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61P 1/16(2006.01) A61P 35/00(2006.01) 审查员 李煦颖 (54)发明名称 一种多重共刺激信号嵌合抗原受体及其用 途 (57)摘要 本发明涉及免疫治疗技术领域， 具体涉及一 种多重共刺激信号嵌合抗原受体及其用途。 一种 多重共刺激信号嵌合抗原受体， 由信号肽、 HBVSAg抗原结合结构域、 胞外铰链区、 跨膜区、 多 重胞内共刺激信号分子和胞内信号转导分子串 联构成。 本发明嵌合体抗原受体T细胞第一信号 被激活时， 第二信号CD28多重共刺激分子可以产 生强烈的集群效应， 杀伤肿瘤细胞。 同时， 这种多 重激活的作用不会像注射CD28的激活型抗体一 样， 引发强烈T细胞免疫， 造成潜在严重毒副作 用； 本发明的嵌合体抗原受体T细胞对HBV阳性肝 癌细胞有很好的杀伤作用， 具有较好的应用前 景。 权利要求书1页 说明书17页 附图3页 CN 113493526 B 2022.10.14 CN 113493526 B 1.一种多重共刺激信号嵌合抗原受体， 其特征在于， 由信号肽、 HB VSAg抗原结合结构域、 胞外铰链区、 跨膜区、 多重胞内共刺激信号分子和胞内信号转导分子串 联构成； 其中编 码靶 向HBVSA嵌合体抗原结合受体的编码基因核酸序列如SEQ  ID NO.9所示。 2.根据权利要求1所述的嵌合 抗原受体， 其特 征在于， 所述信号肽为膜蛋白信号肽； 所述HBVSAg抗原结合结构 域是以HBVSAg抗体为基础， 构建其重链 可变区和轻链 可变区， 并由短肽连接而成； 所述胞外铰链区选自IgG1FCCH2CH3铰链区、 IgG2FCCH2CH3铰链区、 IgG4FCCH2CH3铰链 区、 CD28铰链区和CD 8铰链区中的一种或多种； 所述跨膜区选自CD28跨膜区、 CD8跨膜区、 CD134跨膜区、 CD137跨膜区、 ICOS跨膜区和 DAP10跨膜区中的一种或多种； 所述胞内共刺激信号分子选自CD28胞内结构域、 CD134/OX40胞内结构域、 CD137/4 ‑1BB 胞内结构域、 LCK 胞内结构域、 ICOS胞内结构域和DAP10胞内结构域中的一种或多种； 所述胞内信号 转导分子为CD3ζ 胞内结构域。 3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体， 其特征在于， 所述HBVSAg单链抗体的核酸序列 如SEQ ID NO.1所示； 所述胞外铰链区为 IgG1FC铰链区， 其核酸序列如SEQ  ID NO.2所示； 所述跨膜区为CD28跨膜区， 其核酸序列如SEQ  ID NO.3所示； 所述胞内共刺激信号分子为1XCD28胞内结构域、 2XCD28胞内结构域和/或3XCD28胞内 结构域； 1XCD28胞内结构域核酸序列如SEQ  ID NO.4所示； 2XCD28胞内结构域核酸序列如 SEQ ID NO.5所示； 2XCD28胞内结构域核酸序列如SEQ  ID NO.6所示； 所述CD3ζ 胞内结构域核酸序列如SEQ  ID NO.7所示。 4.一种载体， 其特 征在于， 所述载体包 含权利要求1所述的编码基因。 5.一种细胞， 其特征在于， 所述细胞包含权利要求1 ‑3任一项所述的嵌合体抗原受体， 或包含权利要求 4所述的载体。 6.根据权利要求5所述的细胞为T细胞或其 他免疫细胞。 7.权利要求1 ‑3任一项所述嵌合体抗原受体修饰的细胞在制备治疗HBV引起疾病药物 中的应用， 其特 征在于， 所述疾病为乙肝、 肝硬化或肝癌。 8.一种药物， 其特征在在于， 所述药物包含权利要求1 ‑3任一项所述嵌合体抗原受体修 饰的细胞和核苷酸类似物或干扰素。 9.一种嵌合体抗原受体修饰细胞的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)基因合成编码权利要求1 ‑3任一项所述嵌合体抗原受体的DNA片段， 同时上下游分 别添加双酶切位 点， 合成基因经双酶切后插 入pCDH载体构成质粒； (2)将抗HBVSAg嵌合体抗原受体的表达质粒转染至293T细胞， 包装获得病毒颗粒， 经离 心浓缩后获得慢病毒浓 缩液； (3)慢病毒浓 缩液感染细胞从而获得靶向HBVSAg嵌合体抗原受体修饰的细胞。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 113493526 B 2一种多重共刺激信号 嵌合抗原受体及其用途 技术领域 [0001]本发明涉及免疫治疗技术领域， 具体涉及 一种多重共刺激信号嵌合抗原受体及其 用途。 背景技术 [0002]肿瘤过继细胞治疗(adopt ive cell therapy， ACT)是将经 处理的自体或异体免疫 细胞(主要是自体细胞)回输给肿瘤患者， 直接杀伤肿瘤细胞， 或者通过激发机体的免疫应 答杀伤肿瘤细胞， 达到治疗目的。 当前肿瘤过继细胞治疗发展迅速， 在多种恶性肿瘤的临床 治疗中取得了非常好的疗效。 肿瘤免疫细胞治疗被认为是最有前景的治疗恶性肿瘤的手段 之一。 [0003]嵌合抗原受体(Chimer ic Antigen Receptor‑T cell， CAR ‑T)T细胞是指经基因修 饰后， 能以MHC非限制性方式识别 特定目的抗原， 并且持续活化扩增的T  细胞。 嵌合抗原受 体修饰的T细胞治疗肿瘤是近年来肿瘤治疗领域取得的里程碑式的突破。 其中用于治疗白 血病、 淋巴瘤的CAR ‑T产品CTL019(诺华)和  KTE‑C19(Kite)先后获得美国突破性疗法认证， 其在临床试验中病人的完全缓解率达到70％ ‑94％。 良好的治疗效果促使美国FDA加速药品 审批流程， 在2017  年分别批准以上两家公司的CD19CAR ‑T药物上市。 [0004]肝癌(HCC)是我国最常见的消化系统恶性肿瘤之一， 目前针对肝癌的各种治疗策 略都不能显著延 长肝癌患者的有效生存期。 近年来， 肿瘤免疫治疗取得飞速发展， 在细胞免 疫治疗上取得突破性进展， CAR ‑T技术的发展为肝癌的治疗带来新的曙光。 在针对HCC的 CAR‑T治疗中， 以Glypican ‑3(GPC3)为靶点的  CAR‑T在临床前的研究中显现出良好的肝癌 细胞杀伤作用。 然而， 虽然GPC3  在75％以上的HCC中呈现高表达， 但其并非肿瘤特异性抗 原， 在肺、 肾、 女性 生殖系统等 正常组织中也存在表达， 潜在的多器官脱靶效应不可避免。 [0005]乙型肝炎病毒(Hepatit is B virus， HBV)感染是诱发HCC的重要因素。 作为一种嗜 肝性病毒， HBV可通过多种途径 诱导肝细胞的癌变， 这也是导致我国  HBV相关性肝癌高发的 重要原因。 世界范围内， HBV感染相关的HCC占50％左右， 而在我国HCC患者中有近90％呈现 HBV阳性。 更重要的是， HBV感染宿主细胞后病毒HBV表 面抗原(HBVsAg)可以在肝细胞表面表 达。 [0006]T细胞活化需要两个信号的刺激， 即两种T细胞活化相关信号。 其中， T细胞表面 TCR‑CD3复合体与抗原肽 ‑MHC分子结合， 提供T细胞 活化的第一信号， 决定T细胞的杀伤特异 性； T细胞表面的共刺激分子(如CD28)与相应配体(如  B7)结合， 提供T细胞活化的第二信 号， 促进T细胞活化、 增殖与存活。 但肿瘤细胞第一信号刺激源(如MHC 分子)与第二信号配体 (如B7)等缺乏或表达下降， 无法有效提供T细胞活化相关 的信号， 从而无法激活T细胞免疫 反应。 [0007]嵌合抗原受体CAR通过胞外特异性识别肿瘤抗原的单链抗体片段(Single chain   Variable  Fragment,scFv)， 激活胞内信号CD3ζ或FcεRIγ的  ITAM(immunoreceptor   tyrosine ‑based activation  motifs)信号传递。 但是第一代  CAR受体缺乏T细胞的共刺激说　明　书 1/17 页 3 CN 113493526 B 3