(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202110990164.3 (22)申请日 2021.08.26 (71)申请人 上海市肿瘤研究所 地址 200030 上海市徐汇区斜土路2 200弄 25号 (72)发明人 刘培峰　谢月霞　唐倩云　 (74)专利代理 机构 上海恒慧知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 31317 代理人 邬震中 (51)Int.Cl. A61K 48/00(2006.01) A61K 31/713(2006.01) A61K 39/39(2006.01) A61K 47/42(2017.01) A61K 47/26(2006.01)A61P 35/00(2006.01) B82Y 5/00(2011.01) B82Y 40/00(2011.01) (54)发明名称 一种基于非甲基化CpG纳米疫苗、 制备方法 和应用 (57)摘要 本发明提供了一种基于非甲基化CpG纳米疫 苗、 制备方法和应用。 具体地说是一种基于非甲 基化的胞 嘧啶‑磷酸‑鸟嘌呤(CpG)的脱氧寡核苷 酸(ODNs)纳米疫苗(CpG  DNAsome， CpG纳米疫 苗)， 包括含靶向基团 ‑Y型双链CpG  ODNs‑NGPE (1,2‑二酰基‑sn‑甘油‑3‑磷脂酰乙醇胺， 一种磷 脂)。 还提供了该纳米疫苗在肿瘤治疗药物中的 应用以及作为药物载体的用途。 本发明的CpG   ODNs纳米疫苗可高效荷载与递送DNA/RNA， 具有 靶向巨噬细胞并将其向M1型极化的功能， 特别适 用于负载DNA /RNA用于基因联合放射免疫治疗恶 性肿瘤。 本发明的CpG  ODNs纳米疫苗制备方法简 便、 原料获取便捷， 适用于大规模生产。 权利要求书2页 说明书8页 附图5页 CN 113975408 A 2022.01.28 CN 113975408 A 1.一种基于非甲基化CpG纳米疫苗， 其特征在于， 该疫苗是非甲基化的胞嘧啶 ‑磷酸‑鸟 嘌呤CpG的脱氧寡核苷酸ODNs纳米疫苗Cp G DNAsome， 其含靶向基团 –Y型双链CpG  ODNs–1, 2‑二酰基‑sn‑甘油‑3‑磷脂酰乙醇胺NGPE， 所述的CpG  ODNs和靶向基团的摩尔比为1 ‑3:1， 所述的CpG  ODNs序列如下： 2.根据权利要求1所述的基于非甲基化CpG纳米疫苗CpG  DNAsome， 其特征在于： 所述的 纳米疫苗的粒径为20 0‑300nm， 形态为球形。 3.根据权利要求1所述的基于非甲基化CpG纳米疫苗CpG  DNAsome， 其特征在于： 所述的 靶向基团为具有肿瘤特异性靶向的酶、 抗体、 适配 体或者小分子化 合物。 4.根据权利要求3所述的基于非甲基化CpG纳米疫苗CpG  DNAsome， 其特征在于： 所述的 靶向基团为巨噬细胞 特异性适配体。 5.根据权利要求1所述的基于非甲基化CpG纳米疫苗CpG  DNAsome， 其特征在于： 还可含 有肿瘤抑制基因、 DNA、 siRNA或miRNA， 所述的CpG  ODNs和肿瘤抑制基因、 DNA、 siRNA或miRNA 的质量比为1 ‑3:1。 6.根据权利要求5所述的基于非甲基化CpG纳米疫苗CpG  DNAsome， 其特征在于： 所述的 肿瘤抑制基因为SirT1  siRNA。 7.一种如权利要求1所述的基于非甲基化CpG纳米疫苗CpG  DNAsome的制备方法， 其特 征在于包括如下步骤： (1)一个制备Y型双链CpG  DNA(Y‑CpG DNA)的步骤： 每个单链CpG  ODN分别溶解在退火缓冲液 中， 与等量的相应CpG  ODNs(Y01、 Y02、 Y03)混合 杂交成Y‑CpG DNA。 (2)一个制备Y ‑CpG DNA‑靶向基团的步骤： 先将靶向基团活化， 再将溶于磷酸盐缓冲液中的Y ‑CpG DNA加入到被活化的靶向基团 溶液中， 并在室温下搅拌 反应10～3 0小时后， 纯化获得Y ‑CpG DNA‑靶向基团。 (3)一个制备Y ‑CpG DNA‑靶向基团 ‑lipid复合物的步骤。 NGPE溶解在含有辛基糖苷、 EDC和NHS的MES缓冲液中， 于室温下振荡反应， 再将制备好 的Y‑CpG DNA‑靶向基团加入反应混合物中， 室温孵育后纯化获得Y ‑CpGDNA‑靶向基团 ‑ lipid复合物。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 113975408 A 2(4)将Y‑CpG DNA‑靶向基团 ‑lipid复合物自组装形成荷载非甲基化CpG的纳米疫苗CpG   DNAsome。 8.根据权利要求7所述的基于非甲基化CpG纳米疫苗CpG  DNAsome的制 备方法， 其特征 在于： 所述的Y ‑CpG DNA‑靶向基团 ‑lipid复合物还可通过杂交和自组装， 获得荷载肿瘤抑 制基因的纳米疫苗CpG  DNAsome。 9.根据权利要求7或8所述的基于非甲基化CpG纳米疫苗CpG  DNAsome的制备方法， 其特 征在于： 所述的含有肿瘤抑制基因 时， 制备荷载肿瘤抑制基因的Y型双链CpGDNA即肿瘤抑制 基因‑Y‑CpG DNA的步骤， 将等量的单链CpG  ODN与荷载肿瘤抑制基因正义链的单链CpG  ODN 分别溶解在退火缓冲液中， 制备荷载肿 瘤抑制基因正义链的Y型双链CpG  DNA， 再将等量的 荷载肿瘤抑制基因正义链的Y ‑CpG DNA与肿瘤抑制基因反义链混合杂交合成荷载肿瘤抑制 基因的肿瘤抑制基因 ‑Y‑CpG DNA。 10.根据权利要求7、 8或9所述的基于非甲基化CpG纳米疫苗CpG  DNAsome的制备方法， 其特征在于制备肿瘤抑制基因 ‑Y‑CpG DNA‑靶向基团的步骤中， 先将靶向基团活化， 然后将 溶于磷酸盐缓冲液中的肿瘤抑制基因 ‑Y‑CpG DNA加入到被活化的靶向基团溶液中， 并在室 温下搅拌 反应10～3 0小时后， 纯化获得肿瘤抑制基因 ‑Y‑CpG DNA‑靶向基团。 11.根据权利要求7、 8或9所述的基于非甲基化CpG纳米疫苗CpG  DNAsome的制备方法， 其特征在于： 制备肿瘤抑制基因 ‑Y‑CpG DNA‑靶向基团 ‑lipid复合物的步骤中， 将NGPE溶解 在含有辛基糖苷、 EDC和NHS的MES缓冲液中， 振荡反应， 再将制备好的肿瘤抑制基因 ‑Y‑CpG  DNA‑靶向基团加入反应混合物中， 孵育后纯化获得肿瘤抑制基因 ‑Y‑CpG DNA‑靶向基团 ‑ lipid复合物。 12.根据权利要求7、 8或9所述的基于非甲基化CpG纳米疫苗CpG  DNAsome的制备方法， 其特征在于： 肿瘤抑制基因 ‑Y‑CpG DNA‑靶向基团 ‑lipid复合物通过自组装形成荷载肿瘤 抑制基因的纳米疫苗CpG  DNAsome。 13.一种如权利要求1、 2、 3、 4、 5或6所述的基于非甲基化CpG纳米疫苗CpG  DNAsome在制 备治疗癌症的药物中的应用或作为药物载体的用途。 14.如权利 要求13所述的基于非甲基化CpG纳米疫苗CpG  DNAsome在制备治疗肝癌放疗 增敏药物中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 113975408 A 3