(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202110848038.4 (22)申请日 2021.07.27 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113694128 A (43)申请公布日 2021.11.26 (73)专利权人 吉林化工学院 地址 132022 吉林省吉林市龙潭区承 德街 45号 (72)发明人 周鸿立　孙嘉祺　赵爽　 (51)Int.Cl. A61K 36/89(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 31/12(2006.01) A61P 7/02(2006.01)A61P 9/06(2006.01) A61P 9/12(2006.01) A61P 9/00(2006.01) G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/90(2006.01) (56)对比文件 CN 112438400 A,2021.0 3.05 审查员 黄启和 (54)发明名称 一种响应面法优化乌拉草中含有士的宁的 生物碱的提取工艺 (57)摘要 采用响应面分析方法确定酸水法提取乌拉 草中含有士的宁生物碱的最佳提取工艺并对其 进行鉴别。 选取提取温度、 料液比和盐酸浓度三 个因素， 以乌拉草总生物碱提取率为响应值， 进 行Box‑Benhnke试验设计。 最佳提取工艺为： 提取 时间2h， 盐酸浓度为0.18  mol/L、 提取温度为80 ℃、 液料比为30  mL/g， 生物碱提取率可达到 2.74%。 通过硅胶 柱层析纯化分离生物碱， 理化性 质鉴定， 运用紫外分光光度法鉴定、 薄层色谱法 鉴定、 高效液相色谱法鉴定证明乌拉草生物碱中 存在士的宁 。 权利要求书1页 说明书8页 附图8页 CN 113694128 B 2022.11.08 CN 113694128 B 1.一种响应面法优化乌拉草中含有士的宁的生物碱的提取工艺， 其特征在于包括如下 步骤： （1） 乌拉草烘干恒重后切段； （2） 用一定比例的酸水溶液提取2h， 用纱布过滤， 减压浓缩； 将全部的乌拉草浓缩液， 用 40%氢氧化钠溶液调节pH值在8～10范围内， 再用1:1体积二氯甲烷进行萃取2次， 合并萃取 液用水洗涤直到除去 溶于水的生物碱 盐和碱水， 收集萃 取液浓缩干燥， 得到粗生物碱， 用士 的宁作标准曲线测定生物碱含量； （3） 选择盐酸浓度、 提取温度、 料液比三个因素对步骤 （2） 进行单因素实验， 确定盐酸浓 度、 提取温度、 料液比的最优水平； 以单 因素条件为自变量， 以总生物碱含量为响应值， 得出 最优的提取 条件； （4） 对步骤 （3） 建立的多元二次方程进行响应面分析， 取总生物碱含量为最大值， 得出 最优的提取条件； 其中， 在步骤 （3） 中， 以溶剂浓度A、 提取温度B、 液料比C为影响自变量， 以 乌拉草生物碱含量为响应值， 建立的多元二次方程为： Y=2.74+0.17A ‑0.21B+0.19C ‑ 0.37AB‑8.3100E‑003AC‑0.74BC‑0.81A2‑0.61B2‑0.99C2； 其中， 步骤 （3） 中提取时间为2 h、 盐 酸浓度为0.18mol/L、 提取温度为80℃、 液料比为30mL/g， 乌拉草中生物碱的提取率为2.74 ±1.0%； 对步骤 （2） 得到的粗生物碱经硅胶柱层析纯化与分离后得到乌拉草总生物碱， 通过 硅胶柱层析纯化分离生物碱， 采用干法上样， 硅胶与样品质量比为20:1， 以石油醚： 二氯甲 烷： 无水乙醇： 环己烷 （50:10:5:10） 为洗脱剂洗脱三个柱体积， 除极性较小的杂质； 纯化更 换洗脱剂为二氯甲烷： 无水乙醇： 环己烷 （30:10:10） 洗脱三个柱体积， 洗脱 出含有士的宁的 纯化生物碱； 最后用甲醇： 二氯甲烷 （40:10） 洗脱其它极性大的生物碱， 用生物碱沉淀试剂 检测至洗脱样品无色； （5） 对步骤 （2） 得到的粗生物碱用生物碱沉淀试剂检验呈现阳性显色反应， 经硅胶柱层 析纯化与分离后得到乌拉草总生物碱， 对其进行紫外、 薄层及高效液相色谱鉴别， 确定其中 含有生物碱类化 合物士的宁 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 113694128 B 2一种响应面 法优化乌拉草中含有士的 宁的生物碱的提取工艺 技术领域 [0001]本发明涉及一种优化 生物碱的提取 方法， 以及生物碱中士的宁的鉴别方法。 背景技术 [0002]乌拉草作为一种古老的植物， 其含有丰富的生物活性成分， 是珍贵的植物资源。 广 泛分布于中 国东北部、 四川、 内蒙古、 俄罗斯东部等地， 在医药、 保健等领域具有广阔的发展 前景。 乌拉草有奇特的保暖功能以及透气、 防寒、 抑菌等功能。 目前， 对乌拉草的研究主要集 中在纤维等物理性质方面， 鲜有对其提取液的化学成分的研究。 草提取物中常含有生物碱， 而大多数生物碱都具有抗癌、 抗肿瘤、 抗炎、 抗病毒以及抗血小板凝集、 抗心律失常以及抗 高血压等心血 管疾病的作用。 [0003]文献报道天然产物中生物碱目前的提取方法有水提取法、 酸性水溶液提取法、 碱 性水溶液提取法、 有机溶剂提取法、 冷浸提法、 回流提取法、 索式提取法、 超声波提取法、 膜 提取法、 超临界提取法。 生物碱的提取率和化学成分受很多因素的影响， 常采用正交实验法 或者响应面分析法来优化提取工艺， 确定最佳提取条件。 如赵胜男等人选取盐酸浓度、 料液 体积和提取温度三个因素， 以总生物碱的得率为响应值， 进 行响应面试验设计， 得出白屈菜 生物碱的最优提取条件为盐酸浓度0.42%， 料液体积97.59ml， 提取温度50.12℃， 在此条件 下得到的生物碱为2.7090mg ·g－1。 马志宏等人采用正交试验选取提取时间、 料液比、 pH值 和温度考察对红茂草总生物碱提取率的影响， 得出酸水提取红茂草总生物碱的最佳条件为 温度90℃， 提取时间5h， 料液比1:40， pH值1.5为提取红茂草总生物碱的最佳条件， 并得出异 紫堇碱提取率 为9.28%。 [0004]为了得到纯度较高的生物碱， 将其纯化分离。 生物碱经典的纯化方法包括有机溶 剂萃取法、 盐析法、 沉淀 法、 结晶法、 硅胶柱色谱与大孔吸附树脂法等。 如潘扬等人采用溶剂 提取、 硅胶柱色谱等方法对马钱子发酵品的生物碱成分进行纯化分离， 二氯甲烷 ‑甲醇洗 脱， 按1%甲醇的梯度增加， 依次洗脱， 每个梯度5L， 紫外灯下检视 薄层板， 改良碘化铋钾试剂 显色， 合并相同流分后， 分成3%～4%甲醇、 6%～7%甲醇、 4%～5%甲醇和7%～15%甲醇4个洗脱 部位， 再反复进行硅胶或SephadexLH ‑20柱色谱分离、 重结晶得到10种生物碱成分。 [0005]士的宁属单萜吲哚生物碱类， 是中药马钱子的有效成分， 也是有毒成分， 与马钱子 碱二者约占生物碱的70%。 历来研究结果显示士的宁为中强碱， 在碱性环境下稳定， 士的宁 用酸液提取， 再对酸液进行碱化萃取 的提取方法。 聂彦彦等人 曾采用紫外分光光度法测量 不同炮制方法 （油炸法、 奶制法、 烘烤法、 甘草制法、 砂烫法） 对马钱子中士的宁及马钱子碱 的变化； 曹玲等人采用TLC法对处方中马钱子进 行定性鉴别； 黄月纯等人采用反相高效液相 色谱法， 以甲醇 ‑水 （65:35） （水相含0.029mol ·L‑1磷酸二氢钾及0.037md ·L‑1十二烷基磺 酸钠） 为流动相， 在检测波长为254nm下测定通痹灵片中士的宁的含量， 得出保留时间在 12min左右时供试品与对照品溶液均出现士的宁的吸收峰， 测定 峰面积计算每片通痹灵样 品士的宁平均含量 为0.22mg。 [0006]至今， 对乌拉草中生物碱 的研究较少， 未见对其提取工艺进行优化及结构方面进说　明　书 1/8 页 3 CN 113694128 B 3