(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111660862.3 (22)申请日 2021.12.31 (71)申请人 北京林业大 学 地址 100089 北京市海淀区清华 东路35号 北京林业大 学 (72)发明人 崔亚宁　罗鹏云　钱虹萍　 (74)专利代理 机构 北京盛凡佳华专利代理事务 所(普通合伙) 11947 代理人 安利敏 (51)Int.Cl. C12N 15/82(2006.01) C12N 15/65(2006.01) A01H 5/10(2018.01) A01H 6/20(2018.01) C12N 5/10(2006.01)G01N 21/01(2006.01) G06T 5/00(2006.01) G06T 5/50(2006.01) (54)发明名称 一种超分辨显微技术观察植物原生质体膜 蛋白动态的方法 (57)摘要 本发明公开了一种单分子超分辨显微技术 观察植物原生质体膜蛋白动态的方法， 包括步骤 一， 转基因材料的获得； 步骤二， 原生质体的提 取； 步骤三， 结构光照明显微镜成像观察； 步骤 四， 参数信息的计算； 其中在上述步骤一中， 首先 通过PCR技术扩增目的基因条带， 然后通过双酶 切的方法与真核表达载体35S::pCAMBIA2300 ‑ GFP进行连接， 通过筛选获得转基因拟南芥植株； 使用结构光照明显微镜进行成像， 结构光照明显 微镜具有时间分辨率高、 光毒性和光漂白性小等 众多优点， 能够在活体状态下， 实时观察细胞膜 蛋白的动态变化等特征； 通过结构光照明显微镜 的观察， 可以真实地反映植物细胞膜蛋白分子的 运动状态， 并可以获得膜蛋白运动参数等信息 。 权利要求书2页 说明书5页 附图3页 CN 114317593 A 2022.04.12 CN 114317593 A 1.一种超分辨显微技术观察植物原生质体膜蛋白动态的方法， 其特征在于： 步骤一： 转 基因材料的获得； 步骤二： 原生质体的提取； 步骤三： 结构光照明显微镜成像观察； 步骤四： 参数信息的计算； 其特 征在于： 基因材料获得包括以下步骤： (1)利用PCR技术将目的基因从拟南芥基因组中扩增出来， 然后通过双酶切 ‑T4连接酶 的方法， 将目的基因片段与 真核表达载体35S::pCAMBIA2300 ‑GFP进行连接， 获得带有绿色 荧光融合蛋白的真核表达载体； (2)再通过农杆菌转化的方法侵染到拟南芥野生型植株中， 通过含有相应抗生素的1/2 ×MS固体平板 筛选出T1代转基因植株； 原生质体的提取包括以下步骤： (1)组织培养： 将所述转基因拟南芥种子消毒， 并播种于1/2MS固体培养基上， 4℃春化 24h后， 置 于培养温度为2 2℃， 光照： 黑暗为16： 8的培 养箱中进行培 养； (2)试剂选择： 采用北京酷来博科技有限公司的拟南芥原生质体制备及转化试剂盒进 行拟南芥原生质体制备； (3)选取在培养皿中生长15天左右的拟南芥幼苗， 去除根部， 留取叶片， 用刀片将叶片 切碎并放入酶解液(10mL)， 使其在摇床(26.6℃， 55rpm)上室温避光 酶解3h左右至叶片完全 消化； 待酶解完成后加入与酶解液等体积的溶液II ‑W5 solution稀释原生质体， 然后用 ddH2O冲洗尼龙筛网， 并用其过滤原生质体于一个50mL离心管中以去除没有溶解完全的叶 片残渣； 采用长沙高新技术产业开 发区湘仪离心机仪器有限公司生产的H2100R离心机对样 品进行离心(水平转头， 18℃， 100Xg离心2min， 升降速7)， 完成后弃上清； 用5mL预冷的溶液 II‑W5 solution温柔重悬位于底部的原生质体， 用剪尖的蓝枪头轻轻将原生质体悬起， 100Xg离心1min， 升降速7， 弃去上清； 加入5mL预冷的溶液II ‑W5 solution重悬， 冰上30min 沉降原生质体； 10 0Xg离心1mi n， 升降速7， 加入溶 液II‑W5 solution； 结构光照明显微镜成像观察包括以下步骤： (1)制备样本： 取所得原生质体并进行重悬， 取1微升滴在载玻片上， 并轻轻盖上玻片， 动作尽量轻柔， 避免破坏原生质体； (2)观察： 采用D eltaVisionTM  OMX SR超分辨率显微镜进行成像， 观察时， 滴加镜油， 设 置参数， 其中激发波长设置为488nm， 收集波长设置为500～560nm； 曝光时间为40ms， 激光强 度选择25％， Readout为Fast  272MHz， 对原生质体质膜蛋白进行成像， 连续采集20帧图像并 保留观察结果和备份； (3)图像导出： 将拍摄获得图像进行Deconvolution处理， 即对图像点进行叠加； 接着进 行OMX SI Reconstruction处理， 即对图像去卷积， 获得较为清晰图像； 参数信息的计算包括以下步骤： 采用Image  J软件对所获得的时间序列图像的感兴趣 部分进行截取、 Subtract  Background处理以及对亮度和对比度进行调整， 通过Imaris  X64  9.0.1对目的蛋白进行单颗粒追踪分析， 并获取蛋白动态的不同参数数据信息； 通过Or igin  8对目的蛋白的运动速率， 荧 光强度等 参数进行拟合， 从而确定目的蛋白的动态速率变化。 2.根据权利要求1所述的一种超分辨显微技术观察植物原生质体膜蛋白动态的方法， 其特征在于： 参数信息的计算具体包括以下步骤 (1)在Image  J软件中打开TIF格式的时间序列图像， 选择并截取感兴趣的区域， 选择权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114317593 A 2“框型”图标‑>框出感兴趣部分图像 ‑>Image‑>Crop； 去背景， 选择process ‑>Subtract   Background ‑设置“Rolling Ball Radius”设置为50Pixels； 运行Image ‑>Adjust ‑> Brightnes s/Contrast， 调整图像的亮度和对比度； Ap ply， 保存； (2)在Imaris  X64 9.0.1软件中， 将截取并处理后待分析TIFF格式的图片直接拖入 Imaris软件； 调整Z和T， 选择Image  processing ‑>swap Time and Z； 选择Edit ‑Image  properties ‑>voxel size修改为0.16 μm ‑>all equidistant； 加斑点， 选 择Add new spots， 选中Track  Spots实现单分子追踪 ‑>点击右下角前进按钮； 选中Track  Spots实现单分子追 踪‑>点击右下角前进按钮； 选中需要追踪的通道， Estimate d XY diameters为0.2 μm； 右下 角点击前进‑>all visible Channels‑>前进； 选 择追踪方式为Autoregressive  motion， 最 大距离： 0.64μm， 完成追踪； 导出Excel数据表， 选中Spots ‑>statistics ‑>detailed ‑>All  values中选择需要的参数,例如Track  Intensity  Mean和Track  Speed Mean‑>底部“堆叠 的文件夹样式 ”的按钮可以导出； (3)将导出的数据在OriginPro8软件中进行分析， 右击之后选择Frequency  count， Track Intensity  Mean间隔设置为65， Track  Speed Mean间隔设置为0.22,然后选择 FreqsY列的数据对其进行分析， 得到柱形图。 3.根据权利要求1所述的一种超分辨显微技术观察植物原生质体膜蛋白动态的方法， 其特征在于： 步骤一中获得转基因材料为在植物细胞膜上大量表达， 并具有重要功 能的绿 色荧光融合蛋白GFP。 4.根据权利要求1所述的一种超分辨显微技术观察植物原生质体膜蛋白动态的方法， 其特征在于： 所述 步骤二中将 拟南芥种子放入培 养箱中， 长出4片子叶后使用。 5.根据权利要求1所述的一种超分辨显微技术观察植物原生质体膜蛋白动态的方法， 其特征在于： 选用酶解液去除植物细胞细胞壁以获得原生质体， 所述原 生质体极易破碎， 在 提取过程中动作要十分轻柔， 以免其破碎， 影响提取效果， 重悬时要选用已剪尖的蓝枪头， 减少吸取 液体时的冲力， 避免原生质体破碎。 6.根据权利要求1所述的一种超分辨显微技术观察植物原生质体膜蛋白动态的方法， 其特征在于： 步骤三中观察时， 要滴加镜油， 设置参数， GFP标记的蛋白激发波长设置为 488nm， 收集波长设置为500～560nm； 曝光 时间为40ms， 激光强度选择25％， Readout为Fast   272MHz， 对原生质体质膜蛋白进行成像。 7.根据权利要求1所述的一种超分辨显微技术观察植物原生质体膜蛋白动态的方法， 其特征在于： 所述步骤四中采用Image  J软件对所获得的时间序列图像的感兴趣部分进行 截取、 Subtract  Backgrou nd处理以及对亮度和对比度进行调整， 通过I maris X64 9.0.1对 目的蛋白进行单颗粒追踪分析， 并获取蛋白动态的不同参数数据信息； 通过Origin  8对目 的蛋白的运动速率， 荧 光强度等 参数进行拟合， 从而确定目的蛋白