(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111650256.3 (22)申请日 2021.12.31 (71)申请人 郑州大学 地址 450001 河南省郑州市高新区科 学大 道100号 (72)发明人 翁海波　崔晨阳　孙召伟　杨明妍　 程家萁　王佳佳　亢洁　年嫄茹　 马文杰　赫倩　李金红　陈振宽　 (74)专利代理 机构 郑州联科专利事务所(普通 合伙) 41104 代理人 张晓萍 (51)Int.Cl. C12N 15/115(2010.01) C12N 1/20(2006.01) A61K 47/54(2017.01)A61K 47/69(2017.01) A61K 31/7105(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 改进型AS1411核酸适配体及利用其偶联的 EVs (57)摘要 本申请属于肿瘤生物治疗技术领域， 具体涉 及一种改进型AS1411核酸适配体及利用其偶联 的细胞外囊泡 （EVs） 专利申请。 该改进型AS1411 核酸适配体 结构为： 胆固醇 ‑T碱基‑AS1411； 所述 T碱基为5~13个T碱基。 利用该改进型AS1411核酸 适配体可进一步偶联EVs， 在靶向特定肿瘤细胞 后， 利用EVs所携带药物发挥抗肿瘤作用。 本申请 中通过对现有核 酸适配体AS1411的进 一步改造、 筛选， 获得了可以与大肠杆菌胞外囊泡 （ E.coli  OMVs） 进行较好偶联且具有较好靶向性的新的 9T‑AS1411‑OMVs， 基于此， 可为提高OMVs的靶 向 性和提高其治 疗应用效果奠定良好 技术基础。 权利要求书1页 说明书9页 序列表1页 附图8页 CN 114410636 A 2022.04.29 CN 114410636 A 1.一种改进型AS1411核酸适配体， 其特征在于， 该改进型AS1411核酸适配体结构为： 胆 固醇‑T碱基‑AS1411； 所述T碱基为5~13个T碱基； 所述AS 1411核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所 示， 具体为： T TGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG； 也即， 具体为： 5T‑AS1411： 胆固醇 ‑TTTTT‑TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG， 6T‑AS1411： 胆固醇 ‑TTTTTT‑TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG， 7T‑AS1411： 胆固醇 ‑TTTTTTT‑TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG， 8T‑AS1411： 胆固醇 ‑TTTTTTTT‑TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG， 9T‑AS1411： 胆固醇 ‑TTTTTTTTT‑TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG， 10T‑AS1411： 胆固醇 ‑TTTTTTTTTT  ‑TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG， 11T‑AS1411： 胆固醇 ‑TTTTTTTTTTT‑TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG， 12T‑AS1411： 胆固醇 ‑TTTTTTTTTTTT‑TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG， 13T‑AS1411： 胆固醇 ‑TTTTTTTTTTTTT‑TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG。 2.利用权利 要求1所述改进型AS1411核酸适配体偶联的细胞外囊泡， 其特征在于， 通过 如下步骤制备获得： （一） 提取EVs备用 所述EVs为30~1000 nm的细胞外囊泡EVs， 或者为30~150 nm的外泌体Exosomes， 或者为 大肠杆菌胞外囊泡OMVs； （二） 孵育、 偶联 偶联时将OMV浓度调整为100  μg/mL， 然后取1  mL与15 μL、 10 μM的核酸适配体进行孵 育过夜， 即为偶联有 核酸适配体的大肠杆菌OMVs。 3.如权利 要求2所述改进型AS1411核酸适配体偶联的EVs， 其特征在于， 步骤 （一） 中， 所 述OMVs为大肠杆菌OMVs， 具体提取制备 方法如下： 首先， 将大肠杆菌 菌液100000 g 离心30 min， 弃沉淀， 上清液 再100000 g离心60 min； 随后， 用PBS溶 液重悬沉淀物， 再次10 0000 g离心60 min； 最后， 用PBS溶 液重悬后， 即为含有大肠杆菌 外膜囊泡OMVs溶 液。 4.如权利要求3所述改进型AS1411核酸适配体偶联的EVs， 其特征在于， 所述大肠杆菌 OMVs， 为携带有 治疗作用的小分子miR ‑126的OMVs。 5.如权利 要求3所述改进型AS1411核酸适配体偶联的EVs， 其特征在于， 步骤 （二） 中， 所 述改进型AS1411核酸适配体， 采用5T ‑AS1411或9T ‑AS1411； 具体孵育、 偶联过程为： 4℃振荡 孵育过夜后， 1000  rpm离心1  min， 弃上清， 使用DNA酶进消化30  min后， 再次1000  rpm离心1   min， 弃上清， 沉淀用PBS重悬后即为偶联有 核酸适配体的大肠杆菌OMVs。 6.权利要求2~5任一项所述利用所述改进型AS1411核酸适配体偶联的EVs在制备肿瘤 药剂中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114410636 A 2改进型AS141 1核酸适配体及利用其偶联的 EVs 技术领域 [0001]本申请属于肿瘤生物治疗技术领域， 具体涉及一种改进型AS1411核酸适配体及利 用其偶联的EVs专利申请。 背景技术 [0002]核酸适配体是一段很短的单链DNA或RNA序列， 通过在 体内形成特定的三维空间结 构进而与靶蛋白通过高亲和力结合来发挥一定生理功能。 核酸适配体又被称为化学抗体， 与常规的单克隆抗体相比， 具有稳定性强、 特异性强、 亲和力强等特点。 AS1411是首个进入 临床研究的AS1411， 能特异性的结合癌细胞表面的核仁蛋白， 而核仁蛋白在多种癌细胞膜 表面高表达， 因此 具有较好靶向作用。 [0003]细胞外囊泡 （Extracellular  Vesicles， EVs） 是一种尺寸在30~1000 nm之间的具 有磷脂双分子层膜的球形小囊泡， 普遍存在于各种细胞、 细菌培养上清液和 体液中。 EVs中 包含有细胞来源的蛋白质、 脂质、 DNA、 mRNA、 miRNA等， 参与细胞的通讯、 免疫调节 等反应。 当 EVs直径在30~150 nm时， 可称之为外泌体 （Exo somes） ， 而当EVs直径在150~1000 nm时， 可称 之为微囊泡 （Microvesicles， MVs） 。 研究表明， 细菌也会产生胞外囊泡。 细菌分为革兰氏阳 性细菌跟革兰氏阴性细菌两大类， 革兰氏阳性细菌是单独的细胞壁结构， 其胞外囊泡被称 为EVs； 而革兰氏阴性细菌有两层膜， 外膜跟 内膜， 研究发现， 革兰氏阴性细菌的EVs起源于 外膜， 因此也 叫作 （Outer  Membrane Vesicles， OMVs） 。 [0004]基于细胞外囊泡EVs可以携带药物作用， 现有技术中将其作为载体针对不同类型 肿瘤细胞进 行了较多研究。 但由于细胞外囊泡EVs缺乏一定靶向性， 因此导致其 实际应用效 果较为有限。 而结合核酸适配体的靶向性， 如果能将其与细胞外囊泡EVs进行结合， 则可为 提高细胞外囊泡EVs的应用效果奠定一定技 术基础。 发明内容 [0005]基于现有AS1411核酸适配体， 本申请目的在 于提供一种改进型的AS1411核酸适配 体， 通过将其与EVs的偶联， 从而 更好提高EVs的靶向性， 从而为相关疾病的治疗奠定一定技 术基础。 [0006]本申请所采取的技 术方案详述如下。 [0007]一种改进型AS1411核酸适配体， 其结构为： 胆固醇 ‑T碱基‑AS1411； 所述T碱基为5~ 13个T碱基； 所述AS1411（ 28个碱基）核苷酸序列如SEQ  ID NO .1所示， 具体为： TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG； 也即， 具体为： 5T‑AS1411： 胆固醇 ‑TTTTT‑TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG， 6T‑AS1411： 胆固醇 ‑TTTTTT‑TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG， 7T‑AS1411： 胆固醇 ‑TTTTTTT‑TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG， 8T‑AS1411： 胆固醇 ‑TTTTTTTT‑TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG，说　明　书 1/9 页 3 CN 114410636 A 3