(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111634323.2 (22)申请日 2021.12.2 9 (71)申请人 浙江理工大 学 地址 310018 浙江省杭州市下沙高教园区2 号大街928号 申请人 浙江理工大 学绍兴生物医药研究院 有限公司 (72)发明人 王毅刚　张蕾蕾　龙宇歌　曹玉婷　 李强　周秀梅　黄飚　 (74)专利代理 机构 浙江纳祺律师事务所 3 3257 专利代理师 郑满玉 (51)Int.Cl. C12N 15/85(2006.01) C12N 15/66(2006.01) C12N 15/24(2006.01)C12N 15/19(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 7/01(2006.01) A61K 35/768(2015.01) A61K 38/20(2006.01) A61K 38/19(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法及其应 用 (57)摘要 本发明公开的是本发明提供了一种重组溶 瘤痘苗病毒的构建方法及其应用， 首先在分子水 平以pCB质粒为载体， 通过 酶切连接的方法将IL ‑ 7基因、 CCL19基因和IL ‑7‑F2A‑CCL19基因连接到 载体质粒上， 然后将重组质粒与野生痘苗病毒在 293A细胞内同源重组转染得到表 达IL‑7和CCL19 的重组溶瘤痘苗病毒药物， 在细胞水平上增强了 痘苗病毒对肿瘤细胞的杀伤作用， IL ‑7和CCL19 的表达一定程度上引起了细胞水平一些炎症因 子的表达升高， 在细胞水平显示出对抗肿瘤免疫 的诱导作用。 权利要求书2页 说明书8页 序列表2页 附图9页 CN 115287299 A 2022.11.04 CN 115287299 A 1.一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法， 其特 征在于包括如下步骤： 1)构建TK区缺失的pCB质粒； 2)以pCB质粒为载体， 通过酶切连接的方法将目的基因连接到载体质粒上以构建pCB ‑ IL‑7质粒、 pCB ‑CCL19质粒和pCB ‑IL‑7‑F2A‑CCL19质粒； 目的基因包括IL ‑7基因、 CCL19基因 和IL‑7‑F2A‑CCL19基因； 3)通过脂质体转染， 将步骤2)所得的pCB ‑IL‑7质粒、 pCB ‑CCL19质粒和pCB ‑IL‑7‑F2A‑ CCL19质粒分别转至2 93A细胞， 获得3种重组溶瘤痘苗病毒。 2.根据权利要求1所述的一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法， 其特 征在于： 1)首先应用高保真PCR方法扩增IL ‑7基因片段、 CCL19基 因片段和IL ‑7‑F2A‑CCL19基因 片段； 2)然后将3种基因片段通过限制酶酶切和连接酶连接的方法连接到pCB载体质粒中， 得 到pCB‑hIL‑7质粒、 pCB ‑hCCL19质粒和pCB ‑IL‑7‑F2A‑CCL19质粒； 3)将3种重组质粒和野生病毒通过脂质体转染的方法在293A细胞内同源重组包装病 毒； 4)步骤3)所属野生病毒为经 过改造TK缺失的WR株； 5)包装后经过药物筛选； 6)挑空斑筛选， 药筛后的病毒梯度稀释后铺低熔点胶， 出现病毒空板后挑取空板提基 因组， PCR鉴定是否含有野生病毒基因和目的基因， 鉴定正确后扩增病毒， 获得3种重组溶瘤 痘苗病毒， 分别未 溶瘤痘苗病毒v v‑IL‑7、 vv‑CCL19、 vv‑IL‑7‑F2A‑CCL19。 3.根据权利要求2所述的一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法， 其特征在于： 利用EcoR Ⅰ 和BglⅡ双酶切IL ‑7和pCB质粒， 并将酶切后的大小产物利用连接酶连接， 得到pCB ‑IL‑7重 组质粒； 利用EcoR Ⅰ和XbaⅠ双酶切CCL19和pCB质粒， 并将酶切后的大小产物利用连接酶连 接， 得到pCB ‑CCL19重组质粒； 利用EcoR Ⅰ和XbaⅠ双酶切IL ‑7‑F2A‑CCL19和pCB质粒， 并将 酶 切后的大小产物利用连接酶连接， 得到pCB ‑IL‑7‑F2A‑CCL19重组质粒。 4.根据权利 要求1或2或3所述的一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法， 其特征在于： IL ‑7 的引物如SEQ  ID NO.1或SEQ  ID NO.2所示； CCL19引物如SEQ  ID NO.3或SEQ  ID NO.4所示； IL‑7‑F2A‑CCL19引物如SEQ  ID NO.1或SEQ  ID NO.4所示， IL ‑7基因序列如SEQ  ID NO.5所 示； CCL19基因序列如SEQ  ID NO.6所示； I L‑7‑F2A‑CCL19基因序列如SEQ  ID NO.7所示。 5.根据权利要求2或3所述的一种重组溶瘤痘苗病毒的构建方法， 其特征在于： 步骤5) 中药物筛 选为： 用含有1×黄嘌呤、 次黄嘌呤、 霉酚酸3种药物的培养基筛选重组病毒， 将构建得到的溶 瘤痘苗病毒vv ‑IL‑7、 vv‑CCL19、 vv ‑IL‑7‑F2A‑CCL19感染29 3A细胞2小时后， 用含有1 ×黄嘌 呤、 次黄嘌 呤、 霉酚酸3种药物的培养基培养， 带细胞基本病变， 收集细胞， ‑80℃和37℃反复 冻融3次， 10 00rpm离心5mi ns， 此过程重复至少3次。 6.根据权利要求2或3所述的一种重组溶瘤痘苗病 毒的构建方法， 其特征在于： 鉴定为： 对3种重组溶瘤痘苗病毒进行qPCR、 westernblot和Elisa检测， 检测痘苗病毒感染肿瘤细胞 是否表达I L‑7基因和C CL19基因。 7.根据权利要求6所述的一种重组溶瘤痘苗病 毒的构建方法， 其特征在于： 具体鉴定方 法为： 提取病毒液病毒基因组， PCR鉴定是否含有野生病毒基因和目的基因IL ‑7、 CCL19和权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115287299 A 2IL‑7‑F2A‑CCL19， 选择鉴定正确的病毒液作为种子病毒。 8.根据权利要求2或3或7所述的一种重组溶瘤痘苗病 毒的构建方法， 其特征在于： 还包 括重组溶瘤痘苗病毒的扩增、 纯化和保存步骤： 利用BSC40细胞扩增重组溶瘤痘苗病毒vv ‑ IL‑7、 vv‑CCL19、 vv ‑IL‑7‑F2A‑CCL19； 利用蔗糖梯度离心方法纯化重组溶瘤痘苗病毒； 利用 TCID50法测定重组溶瘤痘苗病毒vv ‑IL‑7、 vv‑CCL19、 vv ‑IL‑7‑F2A‑CCL19的滴度， 最后分装 纯化病毒， 保存于 ‑80℃冰箱。 9.一种重组溶瘤痘苗病毒用在制备治疗消化道恶性肿瘤药物中的应用。 10.一种抑制肝癌细胞增殖的药物， 其特征在于由溶瘤痘苗病毒vv ‑IL‑7、 vv‑CCL19、 vv‑IL‑7‑F2A‑CCL19为原料制成。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115287299 A 3