(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202111675263.9 (22)申请日 2021.12.31 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114431070 A (43)申请公布日 2022.05.06 (73)专利权人 重庆大学 地址 400033 重庆市沙坪坝区正 街174号 (72)发明人 陈玉皎　王贵学　钟莉　王瑾瑄　 曹军　 (74)专利代理 机构 贵州派腾知识产权代理有限 公司 521 14 专利代理师 周黎亚 (51)Int.Cl. A01G 18/00(2018.01) A01G 18/40(2018.01)A01G 18/20(2018.01) A61P 35/00(2006.01) 审查员 陈琛 (54)发明名称 一种蛹虫草 规模化生产方法与应用 (57)摘要 本发明涉及蛹虫草生产及应用技术领域， 具 体涉及一种蛹虫草的规模化生产方法与应用， 本 发明以家 蚕蛹虫草海宁株为菌种， 采用组织复壮 后获得栽培母种， 进一步经过固体培养转液体扩 增制备栽培菌液， 接种后培养获得子实体中虫草 素、 N6‑(2‑羟乙基)腺苷、 麦角甾醇含 量均较高的 蛹虫草； 通过控制生产过程中各环节的技术要点 及关键参数， 设计基于固体培养基的蛹虫草子实 体规模生产， 实现了规模化生产， 生产过程简单 易行， 参数易控制， 且能够获得活性好的有效成 分， 并且有效成分通过特异性调节雌二醇代谢发 挥抗肺癌作用、 特异性调控甘油醛 ‑3‑磷酸脱氢 酶的表达发挥抗 肝癌作用。 权利要求书2页 说明书21页 附图7页 CN 114431070 B 2022.11.25 CN 114431070 B 1.一种蛹虫草的规模化 生产方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 步骤一蛹虫草海宁株 C. militaris 菌种选育 1） 选种： 选择生长健壮、 没有冷凝水或有冷凝水且水珠澄清透明、 子实体根部无白色气 生菌丝的长到2~3cm高的家蚕蛹虫草海宁株子实体； 2） 菌种培育： 在无菌环境中， 采用无菌接菌钩， 钩断子实体根， 取出子实体， 置于灭菌的 纱布上， 用无菌镊子夹住子实体根部， 依次通过75%酒精擦拭子实体表面、 无菌水清洗其表 面残留的酒精、 无菌手术刀去除子实体的表皮， 再选取子实体顶端1~1.5cm长的部位， 每1c m 分成3~5粒， 用无菌接种钩将子实体小粒置于PDA固体培养基上， 子实体粒间隔约3.5cm， 在 22℃生化培养箱内遮光倒置 培养至出现菌 丝； 3） 菌种纯化： 在无菌环境中， 用接种环选取菌种培育环节获得的一环菌丝、 采用连续平 板划线进行菌种分离和纯化， 在21~23℃生化培养箱内倒置 培养至菌丝长到高度约0.5 cm； 步骤二菌种制备 按照每120mL液体培养基接种量为1cm ×1cm的比例， 用无菌手术刀挑取步骤一的菌种 纯化所得的平板单菌落并切碎， 迅速转接于锥形瓶内的液体培养基中， 轻摇使菌种均匀分 布， 扎紧瓶口， 于震荡摇床中22℃、 170rpm、 避光培养， 待菌丝呈雪白色、 均匀、 浓密、 穿透力 强、 无异味， 且菌落 生长大于 培养基平面的1/2面积， 即为质量 合格的可栽培的菌种； 步骤三栽培 1） 发菌初期培养： 采用全自动开盖、 接种和复盖一体机， 向培养瓶中迅速注入2mL菌液 后加盖， 在温度为15~18℃、 空气相对湿度为63~68%条件下黑暗培养3~5天， 保留菌丝呈雪白 色， 长势均匀、 浓密、 穿透力强、 无异味的继续培养至菌丝全部长满整个培养基， 当料面产生 数量不等、 大小不一的多个圆丘状隆起时， 即进入光培养菌株分化前期进 行培养； 所述培养 瓶中装有40g菌种栽培 培养基， 高约2cm； 2） 菌株分化前期培养： 将培养瓶置于温度 为18℃~23℃， 空气相对湿度≥85%， 光照强度 为200~250Lx的条件 下进行光培养3~10天， 至培养基料面菌丝逐渐由白色变为橘黄色后， 继 续培养1~3天即可进入原基期； 在光培养过程中每天光照12h以上， 但不能连续照射， 保证每 日6h黑暗培养， 防止太阳光 直射； 3） 菌株分化原基期培养： 在空气相对湿度为68~72%条件下， 采用温差刺激进行培养10 天， 即可形成原基， 待大量原基形成后保持温度为20~23℃， 空气相对湿度逐渐加大至85%~ 90%， 光照时间延长至15h； 继续培养1~3天， 原基顶端开始出现椎状子实体即可进入子实体 生长前期； 所述温差刺激分为白昼和夜晚两部分， 白昼温度为18~23℃， 光照强度为50~ 100Lx， 时间12 ‑14h； 夜晚温度为5 ‑8℃， 时间为6 ‑10h； 4） 子实体生长前期： 生长前期子实体呈橘黄色， 高1~2cm， 将其置于温度为22℃~25℃， 空气相对湿度为85%~90%的环境中， 每天采用散射光或日光灯进行不连续光照500Lx照射 18h， 培养20~30天， 子实体高2~4cm， 呈长圆锥形时， 即可转入子实体生长后期； 5） 子实体生长后期： 在温度为20~23℃， 空气相对湿度为85%~90%， 光照强度1000Lx条件 下培养10~20天， 且每 日光照时间为18h， 至子实体不再增粗、 增长， 且头部开始膨大， 条状、 生长健壮、 橙黄色为 生长良好的子实体； 步骤四采收储 存 1） 子实体采摘： 蛹虫草子实体呈橘黄色、 头部膨大并有子囊壳出现、 表面有黄色粉末状权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114431070 B 2物出现即为成熟， 采用全自动开盖、 倒置采摘、 培养基清理一体机及时采摘； 采收后的培养 基可循环使用进行二次栽培； 2） 子实体干燥及储 存： 采摘的蛹虫草子实体采用冷冻干燥后于 干燥、 阴凉处保存。 2.如权利要求1所述一种蛹虫草的规模化生产方法， 其特征在于， 所述PDA固体培养基 的制备方法： 取PDA37g、 蚕蛹粉5g、 加入纯净水800mL加热溶解， 搅拌均匀后补 足水分至1L， 按要求分装后  121℃、 30min灭菌备用。 3.如权利要求1所述一种蛹虫草的规模化生产方法， 其特征在于， 所述菌种纯化采用的 培养基的制备 方法： 取P DA 37g， 加水1L加热 溶解， 充分拌匀后于121℃、 3 0min灭菌备用。 4.如权利要求1所述一种蛹虫草的规模化生产方法， 其特征在于， 所述液体培养基的制 备方法： 取葡萄糖20g、 蛋白胨5g、 酵母膏5g、 MgSO41g、 磷酸二氢钾1.5g， 加纯净水至1L搅拌 充分溶解后分装， 于121℃、 3 0min灭菌备用。 5.如权利要求1所述一种蛹虫草的规模化生产方法， 其特征在于， 所述菌种栽培培养基 的制备方法： 取蚕蛹8kg、 大米12kg、 纯化水20kg、 磷酸二氢钾30g、 磷酸二氢钠10g备用， 然后 将蚕蛹与大米磨成粉后混合均匀， 再加入含有磷酸二氢钾和磷酸二氢钠的纯化水， 浆液充 分搅拌至pH 6‑6.5于121℃、 3 0min灭菌后使用。 6.如权利要求1 ‑5任一项所述一种蛹虫草的规模化生产方法生产的家蚕蛹虫草海宁株 子实体中麦角甾醇类化合物通过特异 性调节癌细胞雌二醇代谢和调控癌细胞GAPD H表达从 而发挥癌症诊断或治疗药物制备中的应用。 7.如权利要求1 ‑5任一项所述一种蛹虫草的规模化生产方法生产的家蚕蛹虫草海宁株 子实体中麦角甾醇类化合物通过特异 性调控癌细胞中的E2和GAPD H在抑制癌细胞生长中的 应用。 8.如权利要求1 ‑5任一项所述一种蛹虫草的规模化生产方法生产的家蚕蛹虫草海宁株 子实体中麦角甾醇类化 合物在调节 肺癌细胞中雌二醇代谢中的应用。 9.如权利要求1 ‑5任一项所述一种蛹虫草的规模化生产方法生产的家蚕蛹虫草海宁株 子实体中麦角甾醇类化 合物在上调肝癌细胞中GAP DH表达中的应用。 10.如权利要求6 ‑9任一项所述应用， 其特征在于， 所述麦角甾醇类化合物为 （3 R， 9R， 10S， 13S， 14S， 17S）‑17  ‑ （ （2S， 5R，E）‑5,6  ‑ dimethylhep t‑3  ‑ 烯‑2  ‑ 基）‑10,13‑二甲 基‑2， 3， 4,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ‑十二氢‑1H‑环戊二烯并[a]菲 ‑3‑醇， 简称“DI”， 其 结构式如下： 。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114431070 B 3