ICS 67 X 04 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB 13/T 5159—2019 辣椒红中反式辣椒红素含量的测定 2019 - 12 - 27 发布 河北省市场监督管理局 2020 - 01 - 28 实施 发 布 DB13/T 5159—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由邯郸市市场监督管理局提出。 本标准起草单位：晨光生物科技集团股份有限公司、河北省食品检验研究院、河北省标准化协会。 本标准主要起草人：杨清山、王红、陶晓青、张兰天、刘亚玲、李挥、季邵东、周丽、石文杰、 张建勇。 I DB13/T 5159—2019 辣椒红中反式辣椒红素含量的测定 1 范围 本标准规定了辣椒红中反式辣椒红素的高效液相色谱测定方法。 本标准适用于辣椒红中反式辣椒红素的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 原理 反式辣椒红素是辣椒红的主要成分，属于类胡萝卜素类，其在辣椒红中的天然存在状态是反式辣 椒红素酯。反式辣椒红素酯经过碱液皂化后，均转化为游离的反式辣椒红素。使用紫外-可见分光光度 法测得辣椒红中的总类胡萝卜素含量，再使用高效液相色谱法测得反式辣椒红素在液相图谱中的面积 归一化比例，以总类胡萝卜素含量乘以反式辣椒红素比例得到反式辣椒红素含量。 4 试剂或材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。 4.1 试剂 a) b) c) d) e) f) g) h) 正己烷（C6H14）：色谱纯； 甲醇（CH4O）； 无水乙醇（C2H6O）； 甲苯（C7H8）； 丙酮（C3H6O）：色谱纯； 乙酸乙酯（C4H8O2）：色谱纯； 氢氧化钾（KOH）； 无水硫酸钠（Na2SO4）。 4.2 试剂配制 4.2.1 萃取剂（HEAT）：将正己烷、无水乙醇、丙酮、甲苯按 10:6:7:7 的体积比例混合摇匀。 4.2.2 40%氢氧化钾—甲醇溶液（m/v）：取氢氧化钾 40g（精确至 0.1g）于 250mL 烧杯中，加入约 10 mL 水迅速用玻璃棒搅拌溶解后，加入甲醇 50mL，搅拌至澄清，移入 100 mL 容量瓶中，用甲醇定容、 摇匀静置待用。其应为无色透明液。 1 DB13/T 5159—2019 4.2.3 10%无水硫酸钠溶液（m/v）：称量无水硫酸钠 100g（精确至 0.1g）于 500mL 烧杯中，加水溶 解后转移到 1000mL 容量瓶定容。 4.3 对照品 辣椒红素：（CAS: 465-42-9）：对照品，纯度≥90%。 4.4 标准溶液配制 辣椒红素对照品溶液：将适量对照品溶解至25 mL正己烷中，用作峰位置定性使用，置于-20℃冰 箱保存，有效期1年。 5 仪器和设备 a) b) c) d) 高效液相色谱仪（配备紫外检测器或其他等效检测器）； 紫外-可见分光光度计； 电子天平：感量为 0.1 g 和 0.01 mg； 恒温水浴锅。 6 试验步骤 6.1 样品液制备 称取0.15g（精确至0.1mg）样品置于50 mL容量瓶中，用HEAT定容，摇匀后放在暗处静置10min。 移取5 mL到另一个100mL容量瓶中，再加入25 mLHEAT和4 mL40%的氢氧化钾—甲醇溶液。摇匀后放入25℃ 恒温水浴锅静置皂化30min。皂化完后加入30mL正己烷，用10%的无水硫酸钠定容。剧烈摇动2min放在 暗处静置1 h进行分层（分层后的上层溶液体积为50mL）。移取上清液5mL到50mL容量瓶，用正己烷定 容，得到紫外-可见分光光度计测试液。上清液过0.45μm有机滤膜后用作高效液相色谱仪测试液。 6.2 测定 6.2.1 色谱参考条件 色谱参考条件如下： a) 色谱柱：硅胶填料，250 mm×4.6mm，5m，或性能相当者； b) 流动相：正己烷-丙酮-乙酸乙酯：74+11+15（体积比）； c) 柱温：40℃； d) 检测波长：474 nm； e) 流速：1.5mL/min； f) 进样量：20L。 6.2.2 测定 6.2.2.1 总类胡萝卜素含量测定 将紫外-可见分光光度计测试液用分光光度计在474 nm处，用正己烷做参比液，于1cm比色皿中测 定其吸光值，吸光度应控制在0.3～0.7之间。 6.2.2.2 反式辣椒红素比例测定 2 DB13/T 5159—2019 按照参考液相色谱条件，分别检测辣椒红素对照品溶液和样品高效液相色谱仪测试液，测试液运 行时间需大于2倍的反式辣椒红素保留时间，记录色谱图，见附录A。对样品色谱图中的所有可见峰进 行积分，以辣椒红素对照品中反式辣椒红素的保留时间定性，从积分结果中得出样品中反式辣椒红素 的峰面积百分比。 7 试验结果 7.1 样品中的总类胡萝卜素含量 样品中的总类胡萝卜素含量按公式（1）计算。 W0  A V ……………………………………………（1） M  200 式中： W0——样品中总类胡萝卜素的含量，单位为克每千克（g/kg）； A——样品液在474 nm处测得的吸光值； V——样品液的最终稀释体积，单位为毫升（mL）； M——称取样品的质量，单位为克（g）； 200——质量吸收系数，浓度为1g/L的辣椒红素正己烷溶液，使用1cm比色皿，以正己烷为参比， 在波长474 nm下的吸光值，单位为升每克厘米（L/g·cm）。 7.2 样品中反式辣椒红素含量 样品中的反式辣椒红素含量按公式（2）计算。 W  W0  P ……………………………………………………（2） 式中： W——样品中反式辣椒红素的含量，单位为克每千克（g/kg）； W0——样品中总类胡萝卜素的含量，单位为克每千克（g/kg）； P——反式辣椒红素在液相色谱图中的峰面积百分比。 计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，留三位有效数字。 8 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的3%。 3 DB13/T 5159—2019 AA 附 录 A （资料性附录） 高效液相色谱图 A.1 辣椒红素对照品溶液高效液相色谱图见图A.1。 图A.1 辣椒红素对照品溶液的液相色谱图 A.2 辣椒红样品溶液高效液相色谱图见图A.2。 图A.2 辣椒红样品的液相色谱图 _________________________________ 4