ICS 65.150 B 52 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 3649—2020 水产品中磺胺类药物残留量的测定 酶联免疫吸附法 Determination of residues of sulfonamides in aquatic Products ELISA method 文稿版次选择 2020 - 06 - 22 发布 安徽省市场监督管理局 2020 - 07 - 22 实施 发 布 DB34/T 3649—2020 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省水产技术推广总站提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽国泰众信检测技术有限公司、宁国市金东坊农业开发有限公司、宣城市金水 源水产专业合作社、安徽省水产技术推广总站、合肥市畜牧水产技术推广中心、北京柏奥泰科技有限公 司、合肥金荣生态农业有限公司。 本标准主要起草人：孙德祥、陈洪周、周作友、吴敏、王婷、何广、李瑞、卞红正、许世富、张武 庆、姚杰、李先锋、桂淦、郭恒心、魏泽能、荣朝振、刘传涛、魏涛、钱之云、金家红、刘卫芳、王振、 何超、范希芹、李珺、陈恩全。 I DB34/T 3649—2020 水产品中磺胺类药物残留量的测定 酶联免疫吸附法 1 范围 本标准规定了水产品中磺胺类药物残留量的测定 酶联免疫吸附法的原理、试剂和材料、仪器和设 备、试样制备与保存、测定方法、检测限、准确度和精密度、结果确证。 本标准适用于水产品中磺胺甲噁唑、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺喹噁啉、磺胺对甲氧嘧啶、磺 胺嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺氯哒嗪残留量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 30891 水产品抽样规范 农业部 1077号公告-1-2008 水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱串联质谱法 农业部 1192号公告-1-2009 水产苗种违禁药物抽检技术规范 3 原理 试样中残留的磺胺类药物、酶标记抗原竞争结合磺胺类药物抗体，同时，磺胺类药物抗体又与微孔 板上包被的磺胺类药物的二抗结合，加 TMB 底物后的颜色与试样中磺胺类药物的含量成反比，用酶标 仪在 450 nm 处测定吸光度值，以标准曲线算得对应试样中磺胺类药物浓度，乘以最终试液体积，除以 最终试样质量，即得到含量。 4 试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯；用水应符合 GB/T 6682 规定的二级水。 4.1 乙腈：色谱纯。 4.2 乙酸乙酯：色谱纯。 4.3 正己烷：色谱纯。 4.4 乙腈水溶液：按 84 mL 乙腈：16 mL 水混合。 4.5 氯化钠溶液[2 mol/L]：称取 11.69 g 氯化钠，用水溶解并定容至 100 mL。 4.6 磺胺类药物测定试剂盒： ——2℃～8℃保存，组成参见附录 A。 4.6.1 96 孔酶标板：包被有抗磺胺类药物抗体的捕获抗体（二抗），8 孔/条×12 条 4.6.2 系列标准工作溶液： ——0 ng/mL，0.5 ng/mL，1.5 ng/mL，5.0 ng/mL，15 ng/mL，50 ng/mL 1 DB34/T 3649—2020 4.6.3 磺胺类药物抗体工作液 4.6.4 HRP 标记的磺胺类药物抗原工作液 4.6.5 10 倍样品提取液 4.6.6 20 倍浓缩洗涤液 4.6.7 TMB 底物 4.6.8 终止液 4.7 样品提取液： ——按 10 倍样品提取液（4.6.5）：水（V/V）=1:9 进行稀释。 ——2℃～8℃保存，有效期 1 个月。 4.8 洗涤液： ——按 20 倍浓缩洗涤液（4.6.6）：水（V/V）=1:19 进行稀释。 ——2℃～8℃保存，有效期 1 个月。 5 仪器和设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6 酶标仪：配备 450 nm 滤光片。 分析天平：感量 0.01 g。 组织捣碎机。 漩涡仪。 振荡器或超声波。 离心机：离心力≥4000 g。 氮气吹干装置：温控范围：室温～100℃。 恒温培养箱：温控范围：0℃～60℃，温度均匀度：±0.5℃ 可调移液器： ——单道 20 μL～200 μL、100 μL～1000 μL、500 μL～5000 μL； ——八道 50 μL～300 μL。 试样制备与保存 6.1 试样制备 水产品按 GB/T 30891 的规定执行；水产苗种按农业部 1192号公告-1-2009 规定执行。 采用四分法，将样品分成两等份，装入洁净容器，加封并做标识。 ——取均质后的供试样品，作为供试试样。 ——取均质后的空白样品，作为空白试样。 ——取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。 6.2 试样保存 于 -18℃冰箱中避光保存，保存期 6 个月。 7 测定方法 7.1 2 测定条件 DB34/T 3649—2020 所有操作应在 20℃～25℃室温下进行。试剂盒及所有试剂，使用前应提前 60 min 以上取出，回 升至室温后方可使用。 7.2 试样前处理 称取试样 3 g±0.02 g 于 50 mL 离心管中，加入 9 mL 乙腈水溶液（4.4），振荡或超声 10 min， 离心力 4000 g 离心 10 min；移取 4 mL 上清液（相当于含 1 g 原始试样）到另一 50 mL 离心管中， 加入 2 mL 的氯化钠溶液（4.5）、8 mL 乙酸乙酯（4.2），漩涡振荡 5 min，离心力 4000 g 离心 5 min； 移取 4 mL 乙酸乙酯层上清液（相当于含 0.5 g 原始试样）到另一 10 mL 离心管中，50℃～60℃氮气 吹近干；加 1 mL 样品提取液（4.7），振荡或超声 1 min，加 1 mL 正己烷（4.3）混合 2 min，离心 力 4000 g 离心 5 min，去除上层正己烷层；下清液用作试液。 此最终试液体积（v）为 1 mL，所代表的最终试样质量（m）为 0.5 g。 7.3 酶联免疫测定 7.3.1 测定步骤 将所需的酶标板条插入板架（按每个标准工作液、试液、空白及质控溶液作两个平行计算），并记 录对应位置。每孔加 50 μL 标准工作液或试液，50 μL HRP 标记的磺胺类药物抗原，50 μL 磺胺类药 物抗体，用一次性吸头上下吸附振荡 3 次，轻轻振荡微孔板混匀 1 min，盖板膜，放入恒温培养箱中 于 22.5℃±2.5℃避光孵育 60 min。取出酶标板，孔向下甩出液体，加 250 μL 洗涤液（4.8），轻轻 振荡 15 s 后甩出液体，重复操作 3 次，在吸水纸上拍打，完全除去孔中液体。加 100 L 的 TMB 底 物（4.6.7），轻轻振荡混匀，盖板膜，放入恒温培养箱中于 22.5℃±2.5℃避光孵育 15 min。加 100 μL 终止液（4.6.8），轻振荡混匀，稳定 2 min，用酶标仪于 450 nm 波长处测量吸光度值(读数前， 使用无绒布擦拭微孔底部水分和指模)。 注：不同试剂盒制造商间的产品组成和操作会有差别，应严格按说明书要求规范操作。 7.3.2 空白试验 除不加试样外，其余均按 7.2、7.3.1 进行。 7.3.3 结果计算和表述 用所获得的标准工作溶液和试样溶液吸光度值的比值进行计算，见式(1)： 相对吸光度值A(％)= B ×100％ .............................. (1) B0 式中： A——相对吸光度值(％)； B——非 0 浓度标准工作液或试液的吸光度值； B0——浓度为 0 标准工作液的吸光度值。 以相对吸光度值(％)为纵坐标，标准点浓度（ng/mL）为横坐标建立标准曲线。算得试样中磺胺类 药物的残留量浓度，再乘以最终试液体积（v），除以最终试样质量（m），即可得出试样中磺胺类药物 的残留量结果，按式(2) 计算： X=c× v 1000 × .................................. (2) m 1000 3 DB34/T 3649—2020 式中： X——磺胺类药物含量，单位为微克每千克（μg/kg）； c——从校正曲线算出的试样中磺胺类药物浓度（ng/mL）； v——检测液最终体积，单位为毫升（mL）； m——检测液所代表的最终试样质量，单位为克（g）。 注：结果保留两位有效数字。 计算结果应扣除空白值。 7.4 质量控制 7.4.1 质控要求 每一批测定均应进行平行试验、空白试样测定和空白添加测定。 7.4.2 质控形式 7.4.2.1 平行试验 按以上步骤，对同一标准溶液、试样溶液、空白及质控溶液应进行两个平行试验测定。 7.4.2.2 空白试样测定 测定结果应为阴性。 7.4.2.3 空白添加试样测定 用空白试样添加磺胺类标准溶液，添加浓度水平为试剂盒检测限和相关产品的最大残留限量。 8 方法检测限、准确度、精密度 8.1 检测限 本方法水产品中磺胺类药物的单一药物或混合药物的检测限均为 1 μg/kg。 8.2 准确度 本方法在 1 μg/kg～10 μg/kg的空白添加回收率范围为 70％～120％。 8.3 精密度 本方法的变异系数≤10％。 9 结果确证 本方法测定结果为阳性的样品，应按农业部 1077号公告-1-2008 进行确证。 4 DB34/T 3649—2020 AA 附 录 A （资料性附录） 磺胺类药物酶联免疫测定试剂盒 A.1 A.2 A.3 A.4 A.5 A.6 A.7 A.8 96 孔酶标板：每条 8 孔，一板 12 条 标准溶液 磺胺类药物抗体 HRP标记的磺胺类药物抗原 10×样品提取液 20×浓缩洗液 TMB底物 终止液 酶标板(Sulfonamide Plate)（可拆式） ....................................... 12×8 孔 标准液(Standards)（ng/mL）：0，0.5，1.5，5.0，15，50 ） ................... 6×0.8 mL 回收用标准品 1000（ ng/mL ) ......................................... 0.8 mL 磺胺类药物抗体 (Sulfonamide Antibody) ....