ICS 65.020.20 CCS B 04 辽 DB21 宁 省 地 方 标 准 DB21/T 3458—2021 利用 KASP 标记鉴定蔬菜杂交种纯度 技术规程 Technical Regulation for identification of the purity of vegetable hybrids by KASP marker 2021 - 06 - 30 发布 辽宁省市场监督管理局 2021 - 07 - 30 实施 发 布 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口管理。 本文件起草单位：沈阳农业大学。 本文件起草人：王玉刚、黄胜楠、冀瑞琴、刘志勇、李承彧、章云、任杰、孙云霞、张迎欢、 屈高扬、王汝梅、冯辉。 本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行 反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。 归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话： 024-23447862。 文件起草单位通讯地址：沈阳农业大学（沈阳市沈河区东陵路120号），联系电话：024-88487135。 I DB21/T 3458-2021 利用 KASP 标记鉴定蔬菜杂交种纯度技术规程 1 范围 本文件规定了利用 KASP 标记鉴定蔬菜杂交种纯度技术的引物设计、 DNA 提取和 PCR 扩增等内容。 本文件适用于已完成全基因组测序的蔬菜作物杂交种纯度快速鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本文件。 GB/T 3543（所有部分） 农作物种子检验规程 NY/T 2471 番茄品种鉴定技术规程 InDel 分子标记法 NY/T 2472 西瓜品种鉴定技术规程 SSR 分子标记法 NY/T 2473 结球甘蓝品种鉴定技术规程 SSR 分子标记法 NY/T 2474 黄瓜品种鉴定技术规程 SSR 分子标记法 NY/T 2475 辣椒品种鉴定技术规程 SSR 分子标记法 NY/T 2476 大白菜品种鉴定技术规程 SSR 分子标记法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 全基因组重测序 Whole-genome Resequencing 指对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异 性分析。全基因组重测序的个体，通过序列比对，可以找到大量的单核苷酸多态性位点（SNP）、插 入缺失位点（InDel）、结构变异位点（SV，Structure Variation）和拷贝数变异位点（CNV，Copy Number Variation)。 3.2 KASP 技术 The Kompetitive Allele Specific PCR 指可在广泛的基因组 DNA 样品中，对 SNPs（Single Nucleotide Polymorphisms）和特定位点 上 InDels（Insertion/Deletion）进行精准双等位基因判断的一种标记鉴定方法。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid） Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris hydrochloride） 1 DB21/T 3458-2021 KASP：竞争性等位基因特异性 PCR（Kompetitive Allele Specific PCR） PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction） 5 引物设计 5.1 双亲 SNP、InDel 位点筛选 分别提取双亲的 DNA 进行重测序，根据参考基因组筛选 SNP 和 InDel 位点，并进行重复性检测。 按照 NY/T 2471～2476 给出的方法，借鉴番茄、西瓜、结球甘蓝、黄瓜、辣椒、大白菜等蔬菜作物 核心 SSR 和 InDel 引物设计原则，筛选 KASP 位点。 5.2 KASP 引物设 8BA1 根据双亲重测序筛选的 SNP 和 InDel 位置信息，设计特异正向引物两条，通用反向引物一条。 先将 SNP 或 InDel 所在位点前后各 100bp 序列，从参考基因组或测序结果中提取出来，后进入 SNP 引物设计网站 http://www.snpway.com/，点击“SNP primer”，将该序列放入对话框，点“开 始设计引物”，即可得到想要的引物序列。 5.3 双亲引物多态性筛选 设计的 KASP 标记，以双亲 DNA 为模板进行 PCR 扩增，信号读取，筛选信号强、多态性好的 KASP 标记，每条染色体上筛选至少 2～3 对双亲间存在多态性的引物。 6 仪器设备及试剂 6.1 仪器设备 冷冻干燥机，研磨仪，PCR 仪，万分之一天平；微量加样器，Kube 热封仪，台式离心机，实时 荧光定量 PCR 仪。 6.2 试剂 Tris-HCl（1M），氯化钠，EDTA，异丙醇，无水乙醇，Assay Mix，Master Mix 等。 6.3 溶液配制 见附录 A。 7 KASP 方法步骤 7.1 取样 按照 GB/T3543 的规定对种子进行扦样。每份样品扦取种子数不少于 100 粒，扦样后得到各种蔬 菜作物种子，直播或穴盘育苗，待子叶或真叶长至直径大小约 1cm 时，利用 96 孔深孔板取样。 7.2 DNA 提取 将深孔板放入冷冻干燥机 24h，加入 2 粒钢珠或 4 粒玻璃珠，利用研磨仪研磨 2min，加入 DNA buffer 400μL，55℃水浴 20min，加入异丙醇 400 μL，充分混匀，利用离心机 3700r/min 离心 20min， 弃上清，加入 75%酒精 1000μL，利用离心机 3700r/min 离心 10min，弃上清，晾干后加入重蒸水 200μL。 7.3 PCR 扩增 反应在 384 孔板中进行，反应体系为 3μL。先利用微量加样器分别将 1.5μL 的待测 DNA 模板 2 DB21/T 3458-2021 和空白对照（NTC）加入 384 孔反应板中，不同引物需要分别设置 NTC；再利用微量加样器将 Master Mix 1.5μL 和引物的混液（36:1）加入至 384 孔反应板中，Mix 分装完毕立即将微孔板放在 Kube 热封仪上封膜；运行 PCR 程序（见表 1）。 表 1 KASP 反应程序 Table 1 KASP reaction procedure 温度（℃） 时间（s） 循环数（次） Temperature Time Cycles 95 900 1 94 20 61-55（-0.6/cycle） 60 94 20 55 60 10 26 7.4 分型检测 扩增结束后，利用实时荧光定量 PCR 仪检测荧光信号并查看分型情况。若分型不充分，则进行 加循环程序（见表 2）。每 3 个循环查看分型情况，直至分型完全。 表 2 KASP 加循环反应程序 Table 2 KASP recycle reaction procedure 8 温度（℃） 时间（s） 循环数（次） Temperature Time Cycles 94 20 57 60 3 纯度计算 利用双亲间筛选出的具有多态性的 KASP 引物，一般选 3 对引物，扩增至少 100 粒以上样品的 DNA，每板需分别加入双亲 DNA 作为分型对照，且亲本至少两次重复，通过分型统计，用具有本品种 特征特异带型的种子数占检测样品种子数的百分率来表示纯度，计算公式如下： P%=n/N×100%...................................(1) 式中： P——纯度； n——具有本品种特征特异带型的种子数； N——检测样品种子数。 3 DB21/T 3458-2021 附 录 A （规范性） 溶液配制方法 A.1 DNA buffer 重蒸水 700ml，Tris-HCl 200ml，氯化钠原液（5M）50ml，EDTA 原液（0.5M）50ml，灭菌后使 用。 A.2 引物稀释 首先将两对特异正向引物和通用反向引物分别按照引物合成单的说明配置成 100μmol/L 的储 存液，之后分别吸取 10μL 稀释成 10μmol/L 的工作液，最后按照体积比 12:12:30 的比例混匀，即 得到引物预混液 Assay mix。 A.3 Master mix 混液 Master mix 和 Assay mix 以 36:1 的比例混匀得到混液，其中，Master mix 的体积为样品数 ×1.5μL，配制混液时引物体积忽略不计。 _________________________________ 4