ICS 65.020.01 CCS B05 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2397—2021 黑土区甜叶菊组织培养育苗移栽技术规程 Code of prctice of tissue culture and seedling transplanting of stevia in black soil area 2021-09-26 发布 2021-10-26 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 2397—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。 本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（SAM/TC 20）归口。 本文件起草单位：内蒙古农业大学、内蒙古自治区农牧业技术推广中心、扎赉特旗农牧和科技事业 发展中心。 本文件主要起草人：杨彦明、刘复伟、乌恩、陈新宇、张悦忠、李志新、于长生、潘云鹤、董津蒙、 王凌云、白桂香、艾俊国、陶凤英。 I DB15/T 2397—2021 黑土区甜叶菊组织培养育苗移栽技术规程 1 范围 本文件规定了内蒙古黑土区甜叶菊组织培养育苗移栽技术的无菌环境准备、无菌苗培养、组织培养、 试管苗移栽关键技术。 本文件适用于内蒙古自治区呼伦贝尔市、兴安盟、通辽市。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 13735 聚乙烯吹塑农用地面覆盖薄膜 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 甜叶菊 stevia rebaudiana hemsl. 菊科甜叶菊属多年生草本植物，原产于南美巴拉圭和巴西交界的高山草地。 4 无菌环境准备 4.1 湿热灭菌 培养基（不耐高温成分除外）、无菌水、玻璃器皿（三角瓶、空三角瓶、培养皿）、金属器械（剪 刀、镊子）等采用高压蒸汽灭菌锅进行湿热灭菌处理。灭菌锅内加水至底部有水析出，放入物品、关严 盖子，调整温度121 ℃，时间20 min。待温度上升至95 ℃以上时，将出气阀和安全阀关闭；当气压降 至0.05 Mpa以下时,出气阀和安全阀打开排气，冷却后开盖取出。 4.2 干热灭菌 耐热器械（部分玻璃器皿、坩埚）采用干热灭菌，利用烘箱加热到170 ℃，持续90 min。 4.3 过滤灭菌 植物激素（6-BA、NAA、IBA）采用过滤灭菌。采用滤膜网孔直径0.45 μm以下的微孔过滤灭菌器。 4.4 灼烧灭菌 无菌操作器械采用灼烧灭菌。灼烧灭菌可采用接种用电热灭菌器或酒精灯灼烧灭菌。 1 DB15/T 2397—2021 4.5 擦拭、喷雾灭菌 桌面、墙面、双手、植物材料表面用药剂涂擦、喷雾灭菌，用75 %的酒精或0.1 %的新洁尔灭菌。 超净工作台用75 %的酒精喷洒。 4.6 紫外线灭菌 接种室、培养室定期用紫外灯灭菌。打开室内及超净工作台，用紫外灯杀菌20 min～30 min，关 闭紫外灯，10 min后进入缓冲间。 4.7 熏蒸灭菌 接种室和培养室每年用高锰酸钾和甲醛混合熏蒸1～2次。熏蒸时，关闭房间，用大烧杯盛装甲醛和 高锰酸钾溶液，用量为甲醛10 ml/m³、高锰酸钾5 g/m³，熏蒸2 d～3 d，2 d～3 d后人员方可进入。 5 无菌苗培养 5.1 种子处理 取甜叶菊种子，每10粒1份，在超净工作台内将种子装入无菌离心管中消毒。75 %酒精消毒10 s→ 0.1 %HgCl2消毒6 min，每隔5 s～10 s摇动1次离心管，无菌水冲洗4～5次，后置于无菌滤纸下吸干。 用70 %乙醇30 s→0.1 %HgCl2消毒6 min→15 %H2O2消毒20 min，每隔5 s～10 s摇动1次离心管，无菌水 冲洗4～5次，后置于无菌滤纸下吸干。 5.2 种子装瓶 将灭菌后装有培养基的三角瓶在超净工作台内打开，封口膜倒放于台面。将消毒、吸水干燥后的种 子用镊子均匀播于培养基上，播后将瓶口用酒精灯灼烧灭菌，冷却后封口、扎紧。 5.3 种子培养 将播种后的三角瓶在25 ℃恒温培养箱内暗培养至发芽后，继续保持光照10 h/d～16 h/d培养至苗 高3 cm～5 cm待用。 6 组织培养 6.1 培养基选择及制备 6.1.1 MS 培养基 取40 gMS粉，溶于1 L蒸馏水，调pH为5.8，加琼脂5 g，灭菌20 min后，冷却备用。 6.1.2 1/2MS 培养基 取20 gMS粉，溶于1 L蒸馏水，调pH为5.8，加琼脂8.5 g，灭菌20 min后，冷却备用。 6.1.3 诱导培养基 MS+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂。 2 DB15/T 2397—2021 6.1.4 增殖培养基 MS+1.0 mg/L6-BA+O.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂。 6.1.5 生根培养基 1/2MS+0.1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.2 mg/LIBA+20 g/L蔗糖+7 g/L琼脂。 6.2 材料选择及接种 取无菌苗上的带腋芽茎段作为外植体，用蒸馏水冲洗干净，将茎段切割成1 cm左右带腋芽小茎段， 于超静工作台上用75 %酒精消毒10 s，再用0.1 % HgCl2消毒6 min，每隔5 s～10 s搅动1次，无菌水冲 洗5次，消毒处理后的外植体，接种在MS培养基中，约30 d后腋芽长成芽苗。无菌苗可作为组织培养外 植体，在超净工作台中将无菌苗切下1 cm左右小段，转移至诱导培养基。 6.3 培养条件 培养温度为24 ℃～28 ℃，光照时间为16 h/d，光照强度为2000 lx。 6.4 试管苗增殖 将无菌苗切成单株，接种于增殖培养基中，每瓶接种5株。 6.5 试管苗生根 选取生长状态基本一致的试管苗，并将苗切成单株，接种于生根培养基中，每瓶接种5株。 7 试管苗移栽 7.1 试管移栽 将试管苗根部培养基清洗干净移栽于苗盘，以湿润河沙为栽培基质，覆盖塑料薄膜，温度控制在 20 ℃～30 ℃，中午适当遮荫，20 d后统计试管苗成活率。塑料薄膜使用符合GB 13735的规定。 7.2 大田移栽 当地日平均气温稳定在12 ℃～15 ℃，0 cm～10 cm地温稳定在10 ℃以上，且晚霜结束后即可大田 移栽。 3