中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 出口蜂产品中多种游离氨基酸的测定 液相色谱 -质谱 /质谱法 Determination of multiple free amino acids in bee products for export — LC‑MS/MS methodICS 67.050 CCS X 04 2025 ‑12‑11发布 2026 ‑07‑01实施 中华人民共和国海关总署 　发 布 SN/T 5897—2025SN/T 5897—2025 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第 1部分：标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 。 本文件起草单位 ：中国海关科学技术研究中心 、北京中认检测服务技术有限公司 、武汉产品质量监督 检验所、河北中烟工业有限责任公司技术中心 、漯河市产品质量检验检测中心 。 本文件主要起草人 ：韩深、王珮玥、梁娜娜、古瑾、黄惠敏、徐淇淇、曾爱民、何爱民。 ⅠSN/T 5897—2025 出口蜂产品中多种游离氨基酸的测定 液相色谱 -质谱 /质谱法 1 范围 本文件描述了蜂产品中 17种游离氨基酸的液相色谱 -质谱 /质谱测定方法 。 本文件适用于蜂蜜 、蜂王浆、蜂花粉及蜂胶中游离甘氨酸 、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苏氨酸、 羟脯氨酸 、异亮氨酸 、亮氨酸、天冬氨酸 、赖氨酸、谷氨酸、组氨酸、苯丙氨酸 、精氨酸、酪氨酸和胱氨酸的 测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件 ；不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本 文件。 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 4 方法提要 样品（蜂胶样品先经乙醇溶解 ）经沸水冲泡水浴提取后 ，经微孔滤膜过滤 ，液相色谱 -质谱 /质谱仪测 定，外标法定量 。 5 试剂和材料 除另有说明外 ，所用试剂均为色谱纯 ，水为 GB/T 6682规定的一级水 。 5.1 试剂 5.1.1 甲酸（HCOOH ） 。 5.1.2 乙酸（CH 3COOH） 。 5.1.3 乙腈（CH 3CN） 。 5.1.4 乙醇（C2H5OH） ：分析纯。 5.2 试剂配制 5.2.1 0.1%甲酸水溶液 ：吸取 100 μL甲酸（5.1.1） ，用水稀释至 100 mL，混匀。 5.2.2 1%乙酸水溶液 ：吸取 10 mL乙酸（5.1.2） ，用水稀释至 1 000 mL，混匀。 1SN/T 5897—2025 5.3 标准品 17种氨基酸标准品 ：纯度不小于 98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质 。17种氨基 酸的中英文名称及缩写 、分子式、相对分子质量 、CAS号等化合物信息见附录 A中表 A.1。 5.4 溶液配制 5.4.1 单一氨基酸标准储备溶液 （1 mg/mL） ：分别称取 10.00 mg（精确至 0.01 mg）17种氨基酸标准品 ， 用0.1%甲酸水溶液 （5.2.1）溶解并定容至 10 mL，混匀，每种氨基酸标准储备液的浓度为 1 mg/mL ，4 ℃ 储存，苯丙氨酸有效期 2个月，其余氨基酸有效期 3个月。 5.4.2 混合氨基酸标准储备溶液 （10 μg/mL） ：分别准确吸取 0.5 mL 17种氨基酸标准储备液 （5.4.1） ，至 50 mL容量瓶中 ，用0.1%甲酸水溶液 （5.2.1）稀释并定容 ，混匀，4 ℃储存，有效期 1个月。 5.4.3 混合氨基酸标准中间溶液 （500 ng/mL） ：准确吸取 0.5 mL混合氨基酸标准储备溶液 （5.4.2） ，至 10 mL容量瓶中 ，用0.1%甲酸水溶液 （5.2.1）稀释并定容 ，混匀，临用现配 。 5.4.4 标准工作溶液 ：分别准确吸取 0.02 mL、0.04 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、1 mL和2 mL的混合氨 基酸标准中间溶液 （5.4.3）于10 mL容量瓶中 ，用水稀释并定容 ，混匀。17种混合氨基酸的系列标准溶液 质量浓度分别为 1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL。临用现配 。 6 材料 6.1 锥形瓶：250 mL。 6.2 容量瓶：10 mL、50 mL、250 mL。 6.3 定性滤纸 。 6.4 微孔滤膜 ：0.22 µm，尼龙材质 。 7 仪器和设备 7.1 液相色谱 -质谱 /质谱仪：配有电喷雾离子源 （ESI） 。 7.2 电子天平 ：感量为 0.001 g和0.000 01 g。 7.3 组织捣碎机 ：转速 18 000 r/min。 7.4 恒温水浴锅 ：室温 ~100 ℃。 8 测定步骤 8.1 试样制备 8.1.1 蜂蜜：取代表性样品约 100 g，搅拌均匀 ，装入洁净容器 ，密封并做好标记 ，置于阴凉干燥处 。 8.1.2 蜂花粉：取代表性样品约 100 g，使用组织捣碎机 （7.3）捣碎，装入洁净容器 ，密封并做好标记 ，4 ℃ 及以下保存 。 8.1.3 蜂王浆：取代表性样品约 100 g，搅拌均匀 ，装入洁净容器 ，密封并做好标记 ，-18 ℃及以下保存 。 8.1.4 蜂胶：取代表性样品约 100 g，使用组织捣碎机 （7.3）捣碎，装入洁净容器 ，密封并做好标记 ，置于阴 凉干燥处 。 8.2 提取 8.2.1 蜂蜜：称取样品 2 g（精确至 0.001 g）于250 mL锥形瓶（6.1）中，加入 100 mL~ 200 mL沸水冲泡样 2SN/T 5897—2025 品，摇匀，将样品充分溶解 。放入 90 ℃± 5 ℃水浴锅中 ，水浴 10 min，期间用手振摇一次 ，取出后冷却至室 温，将样品溶液转移至 250 mL容量瓶（6.2）中，用少量水洗涤锥形瓶 2次~3次，洗涤液全部转移至容量 瓶中，用水定容至刻度 ，混匀，经0.22 μm微孔滤膜 （6.4）过滤后待测 。 8.2.2 蜂花粉和蜂王浆 ：称取样品 0.2 g（精确至 0.001 g）于250 mL锥形瓶（6.1）中，加入 100 mL~ 200 mL沸水冲泡样品 ，摇匀，使样品充分浸泡 。放入 90 ℃± 5 ℃水浴锅中 ，水浴 10 min，期间用手振摇一 次，取出后冷却至室温 ，将样品溶液经定性滤纸 （6.3）过滤至 250 mL容量瓶（6.2）中，用少量水洗涤锥形 瓶2次~3次，洗涤液全部过滤至容量瓶中 ，用水定容至刻度 ，混匀，经0.22 μm微孔滤膜 （6.4）过滤后 待测。 8.2.3 蜂胶：称取样品 2 g（精确至 0.001 g）于250 mL锥形瓶（6.1）中，加入 10 mL乙醇（5.1.4） ，将样品全 部溶解，加入 100 mL~ 200 mL沸水冲泡样品 ，摇匀。放入 90 ℃± 5 ℃水浴锅中 ，水浴 10 min，期间用手 振摇一次 ，取出后冷却至室温 ，将样品溶液经定性滤纸 （6.3）过滤至 250 mL容量瓶（6.2）中，用少量水洗 涤锥形瓶 2次~3次，洗涤液全部转移至容量瓶中 ，用水定容至刻度 ，混匀，经0.22 μm微孔滤膜 （6.4）过 滤后待测 。 8.3 测定条件 8.3.1 液相色谱参考条件 液相色谱参考 条件如下 。 a）色谱柱：五氟苯基色谱柱 （150 mm× 2.1 mm，3.0 μm） ，或性能相当者 。 b）流动相：A：1%乙酸水溶液 （5.2.2） ；B：乙腈（5.1.3） ；梯度洗脱程序见表 1。 c）流速：见表 1。 d）进样量：5 μL。 e）柱温：40 ℃。 表1　液相色谱梯度洗脱条件 时间 /min 0 8.5 8.6 12.5 12.6 14.6 14.7 17.0 17.1 18.0流速 /（mL/min） 0.2 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.2 0.2流动相 A/% 94 94 707010 10 94 94 94 94流动相 B/% 6 6 30 3090 90 66 6 6 8.3.2 质谱参考条件 质谱参考 条件如下 。 a）离子源：电喷雾离子源 （ESI） 。 b）检测方式 ：多反应监测模式 （MRM） 。 3SN/T 5897—2025 c）扫描方式 ：正离子模式扫描 。 d）雾化气和干燥气均为氮气 ，加热气为空气 ，碰撞气为氩气 ，或其他合适气体 。使用前应调节相应 参数使质谱灵敏度达到检测要求 ，参考条件详见附录 B。定量离子对 、定性离子对和碰撞能量 信息详见表 B.1。 8.3.3 定性测定 按照液相条件和质谱条件测定标准工作液和试样 ，在相同试验条件下 ，样品中待测物质的保留时间 与标准溶液中对应的保留时间偏差在 ±2.5%之内；且样品中待测组分定性离子的相对丰度与浓度相当 的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较 ，允许偏差不超过表 2规定的范围 ，则可判定为样品 中存在对应的待测目标化合物 。 表2　定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 /% 最大允许偏差 /%>50 ±20>20~50 ±25>10~20 ±30≤10 ±50 8.3.4 定量测量 将混合标准工作液和样品溶液依次注入液相色谱 -质谱 /质谱仪中 ，以峰面积为纵坐标 、标准工作溶 液浓度为横坐标 ，