中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 食品和保健品中益生菌种的检测方法 SYBR Green 荧光 PCR法 Detection of commercial probiotic strains in food and probiotic product—SYBR Green real‑time PCRICS 07.100.30 CCS X 04 2025 ‑12‑11发布 2026 ‑07‑01实施 中华人民共和国海关总署 　发 布 SN/T 5889—2025SN/T 5889—2025 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第 1部分：标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 。 本文件起草单位 ：中国海关科学技术研究中心 、杭州海关技术中心 、浙江迪谱诊断技术有限公司 。 本文件主要起草人 ：汪琦、李可、李丹、曹嘉悦、郭悠然、魏海燕、胡慧静、徐蕾蕊、徐晶、马丹、魏咏新、 赵晓娟、杨丽莉。 ⅠSN/T 5889—2025 食品和保健品中益生菌种的检测方法 SYBR Green 荧光 PCR法 1 范围 本文件描述了食品和保健品中常见益生菌种的 SYBR Green 荧光 PCR检测方法 。 本文件适用于食品和保健品中双歧杆菌属 （Bifidobacterium spp.） 、青春双歧杆菌 （B. adolescentis ） 、动 物双歧杆菌乳亚种 （B. animalis subsp . lactis） 、动物双歧杆菌动物亚种 （B. animalis subsp . animalis） 、两歧双 歧杆菌（B. bifidum） 、短双歧杆菌 （B. breve） 、长双歧杆菌长亚种 （B. longum subsp . longum） 、长双歧杆菌婴 儿亚种（B. longum subsp . infantis） 、嗜酸乳杆菌 （Lactobacillus acidophilus ） 、卷曲乳杆菌 （Lactobacillus cris ⁃ patus） 、德氏乳杆菌 （Lactobacillus delbrueckii ） 、德氏乳杆菌保加利亚亚种 （Lactobacillus delbrueckii subsp . bulgaricus ） 、格氏乳杆菌 （Lactobacillus gasseri ） 、瑞士乳杆菌 （Lactobacillus helveticus ） 、短乳杆菌 （Lactoba ⁃ cillus breve ） 、詹氏乳杆菌 （Lactobacillus jensenii ） 、干酪乳酪杆菌 （Lacticaseibacillus casei ） 、副干酪乳酪杆菌 （Lacticaseibacillus paracasei ） 、鼠李糖乳酪杆菌 （Lacticaseibacillus rhamnosus ） 、发酵黏液乳杆菌 （Limosilac ⁃ tobacillus fermentum ） 、罗伊氏黏液乳杆菌 （Limosilactobacillus reuteri ） 、植物乳植杆菌 （Lactiplantibacillus plantarum ） 、唾液联合乳杆菌 （Ligilactobacillus salivarius ） 、清酒广布乳杆菌 （Latilactobacillus sakei ） 、唾液 链球菌嗜热亚种 （Streptococcus salivarius subsp . thermophilus ） 、乳酸乳球菌乳亚种 （Lactococcus lactis subsp. lactis）和乳脂乳球菌 （Lactococcus cremoris ）的SYBR Green 荧光 PCR定性检测 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件 ；不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本 文件。 GB 4789 .35　食品安全国家标准　食品微生物学检验　乳酸菌检验 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489　实验室　生物安全通用要求 GB/T 27403　实验室质量控制规范　食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 3.1 SYBR Green 实时荧光 PCR　SYBR Green real‑time PCR 在PCR反应体系中加入 SYBR Green 荧光染料 （该染料只与双链核酸分子结合 ） ，PCR扩增时，随着 目标片段数量的增加 ，结合的染料分子数量也增加 ，从而利用荧光信号的积累实时监控整个 PCR扩增 过程。 3.2 Ct值 cycle threshold value 每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数 。 1SN/T 5889—2025 3.3 熔解曲线 melting curve 反应随温度升高 DNA的双螺旋结构降解程度的曲线 。 3.4 Tm值 melting temperature 熔解温度 （即总的 DNA双螺旋结构降解一半的温度 ） 。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 DNA：脱氧核糖核酸 （deoxyribonucleic acid ） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸 （deoxyribonucleoside triphosphate ） PCR：聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction ） 5 方法提要 以样品中提取的 DNA为模板，采用菌属 、菌种或亚种特异性 PCR引物，进行实时荧光 PCR的扩 增，检测其中是否含有目标菌属 、菌种或亚种的特异性基因序列 ，实现对目标菌属 、菌种或亚种定性检测 的目的。 6 试剂 除另有特殊说明外 ，所有试验用试剂均为分析纯 ，试验用水符合 GB/T 6682中一级水的要求 。所有 试剂均用无 DNA酶污染的容器分装 。 6.1 细菌 DNA提取试剂盒 。 6.2 引物：按附录 A。 6.3 溶菌酶。 6.4 荧光定量预混试剂 （SYBR Green ） 。 6.5 TE缓冲液（Tris‑HCl 、EDTA缓冲液） ：10 mmol/L Tris‑HCl （pH8.0） ，1 mmol/L EDTA （pH8.0） 。 7 主要仪器和设备 7.1 恒温水浴锅或加热装置 ：100 ℃。 7.2 恒温培养箱 ：36 ℃± 1 ℃。 7.3 离心机：最大转速 13 000 r/min以上。 7.4 天平：感量 0.1 g。 7.5 冰箱：-20 ℃~ 4 ℃。 7.6 涡旋振荡器 。 7.7 可调移液器 ：1 µL~ 1 000 µL。 7.8 荧光 PCR仪。 2SN/T 5889—2025 8 检测步骤 8.1 样品 DNA的提取 直接称取 1 g或吸取 1 mL样品，加入 9 mL生理盐水 ，涡旋振荡混匀后放置 10 min~ 15 min，从贴近 液面处取 1 mL稀释液，13 000 r/min离心 5 min。沉淀充分重悬于 150 μL TE溶液，加入 30 μL溶菌酶 （50 mg/mL） ，36 ℃孵育 1 h后按照细菌 DNA提取试剂盒的说明书进行 DNA提取。酸奶、米精华等不溶 成分比较多的样品 ，取1.5 mL稀释液，2 000 r/min离心 5 min后取上清液 1 mL，13 000 r/min离心 5 min， 沉淀用于 DNA提取。对于果冻类或胶质糖果类样品 ，应将样品液氮研磨成粉末后称取 1 g用于 DNA 提取。经特殊技术 （如包埋技术 ）处理的样品 ，应在相应技术 /工艺要求下进行有效前处理后提取 DNA。 8.2　DNA浓度和纯度的测定 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260 nm和280 nm处的吸光度值 。DNA的质量 浓度按式 （1）计算，当OD 260/OD 280比值在 1.5~2.1之间时，适宜于 PCR扩增。扩增前将样品 DNA浓度 调至约 10 ng/ μL~50 ng/ μL。 C=A×N×50/1 000 …………………………… （ 1 ） 式中： C——DNA质量浓度 ，单位为纳克每微升 （ng/μL） ； A——260 nm处的吸光度值 ； N——核酸稀释倍数 。 8.3 荧光 PCR检测 8.3.1 荧光 PCR反应体系 荧光 PCR反应所用引物按附录 A，荧光 PCR反应体系见表 1。也可采用其他等效商品化的 PCR扩增体系。 表1　荧光 PCR反应体系 组分 荧光定量预混试剂 （SYBR Green ） （2×） 上游引物 （10 µmol/L） 下游引物 （10 µmol/L） DNA模板 去离子水加样量 /µL 10 0.2 0.2 1 8.6终浓度 1× 100 nmol/L 100 nmol/L — — 8.3.2 阳性对照 、阴性对照和空白对照设置 检测过程中分别设阳性对照 、阴性对照和空白对照 。阳性对照采用含有检测序列的 DNA（或质粒） 作为荧光 PCR反应的模板 ，阴性对照采用不含有检测序列的 DNA（或质粒）作为荧光 PCR反应的模 板，空白对照用无菌水代替荧光 PCR反应的模板 。 8.3.3 荧光 PCR反应程序 荧光 PCR反应循环参数为 ：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，30个循环；熔