中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 出口食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌 （椰毒假单胞菌酵米面亚种 ）检测方法 实时荧光 PCR法 Detection method of Burkholderia gladioli （Psedomonas cocovenenans subsp. farino fermentans ） in food for export —Real‑time PCR methodICS 07.100.20 CCS X 04 2025 ‑12‑11发布 2026 ‑07‑01实施 中华人民共和国海关总署 　发 布 SN/T 5888—2025SN/T 5888—2025 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第 1部分：标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 。 本文件起草单位 ：拱北海关技术中心 、珠海粤港食品安全检测有限公司 、杭州海关技术中心 。 本文件主要起草人 ：冯家望、黎财慧、游淑珠、唐食明、姚丽锋、王小玉、李可、张晴阳、曾俊洁、陈敬。 ⅠSN/T 5888—2025 出口食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌 （椰毒假单胞菌酵米面亚种 ）检测方法 实时荧光 PCR法 1 范围 本文件描述了出口食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌 （椰毒假单胞菌酵米面亚种 ） ［Burkholderia gladio ‑ li （Psedomonas cocovenenans subsp . farino fermentans ） ］实时荧光 PCR检测方法 。 本文件适用于出口食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌 （椰毒假单胞菌酵米面亚种 ）的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件 ；不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本 文件。 GB 4789 .29　食品安全国家标准　唐菖蒲伯克霍尔德氏菌 （椰毒假单胞菌酵米面亚种 ）检验 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489　实验室　生物安全通用要求 GB/T 27403 —2008　实验室质量控制规范　食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 3.1 实时荧光 PCR real time PCR 在PCR扩增时加入带有荧光基团的特异性探针 （TaqMan探针）或荧光染料 ，使PCR产物的积累与 荧光信号的积累完全同步 ，实现 PCR产物的实时监测 。 3.2 Ct值 Cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 BHQ 1：黑洞淬灭剂 ‑1（black hole quencher‑ 1） bonM基因：编码米酵菌酸生物合成基因簇中甲基转移酶的基因 （the gene encoding O‑methytransferase of bongkrekic acid biosynthentic gene cluster ） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵 （cetyltrithylammonium bromide ） DNA：脱氧核糖核酸 （deoxyribonucleic acid ） 1SN/T 5888—2025 dATP：脱氧腺苷三磷酸 （deoxyadenosine triphosphate ） dCTP：脱氧胞苷三磷酸 （deoxycytidine triphosphate ） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸 （deoxyguanosine triphosphate ） dNTP：脱氧核苷酸三磷酸 （deoxyribonucleoside triphosphate ） FAM：6‑羧基荧光素 （6‑carboxy fluorescein ） PCR：聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction ） Tris： 三（羟甲基）氨基甲烷 ［tris（hydroxy methyl ）aminomethane ］ 5 方法原理 本方法通过特异性引物和探针进行唐菖蒲伯克霍尔德氏菌 （椰毒假单胞菌酵米面亚种 ）的特异性 bonM基因序列的实时荧光 PCR扩增，根据 Ct值进行判定 ，实现食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌 （椰毒假 单胞菌酵米面亚种 ）的检测。 6 主要设备及耗材 6.1 天平：感量 0.1 g。 6.2 均质器。 6.3 恒温培养箱 ：36 ℃± 1 ℃。 6.4 高速冷冻离心机 ：离心力 12 000g。 6.5 涡旋振荡仪 。 6.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 。 6.7 Ⅱ级生物安全柜 。 6.8 实时荧光 PCR仪。 6.9 不同量程移液器 ：100 μL~1 000 μL、20 μL~200 μL、10 μL~100 μL、0.5 μL~10 μL。 6.10 离心管：2 mL、1.5 mL和0.2 mL。 6.11 PCR管。 7 材料与试剂 除另有规定外 ，试剂为分析纯或生化试剂 。实验用水应符合 GB/T 6682中一级水的规格 。所有试 剂均用无 DNA酶污染的容器分装 。 7.1 GVC增菌液：成分和配制方法见 GB 4789 .29。 7.2 mPDA平板：成分和配制方法见 GB 4789 .29。 7.3 PCFA平板：成分和配制方法见 GB 4789 .29。 7.4 生理盐水 。 7.5 DNA提取液：称取 0.1 g chelex 100粉末，加入 100 mL灭菌蒸馏水中 ，摇匀即可 。也可使用商业化 的DNA提取试剂盒 。 7.6 Taq DNA聚合酶。 7.7 dNTP：dATP、dTTP、dCTP、dGTP。 7.8 10×PCR 缓冲液：200 mmol/L Tris‑HCl （pH 8.4） ，200 mmol/L KCl ，15 mmol/L MgCl 2。 7.9 阳性质控菌株 ：唐菖蒲伯克霍尔德氏菌 （椰毒假单胞菌酵米面亚种 ）BNCC 354544或其他等效标准 菌株。 2SN/T 5888—2025 7.10 阴性质控菌株 ：大肠埃希氏菌 ATCC 25922或其他等效菌株 。 7.11 实验用引物探针见表 1，扩增片段序列见附录 A（GenBank ：JX173632 .1） 。实时荧光 PCR扩增的 引物和探针加超纯水配制成 100 μmol/L储备液，工作液需用储备液稀释至 10 μmol/L。 表1　引物探针序列 名称 bonM‑ F bonM‑ R bonM‑ P引物探针序列 （5′→3′） TACCACCGAGCAGTTCATGG ATGAAGGTCTCGTCGGCTTG FAM ‑ATACAGCCGCGACAGGTTCCAGT ‑BHQ 1目的基因 bonM 8 技术路线 技术路线见图 1。  
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I 8" %/"E=1$3 *89 %/"E=1$3 (#
E=-@N1%" 1$'"K K K  *89 图1　食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌 （椰毒假单胞菌酵米面亚种 ）检测流程图 3SN/T 5888—2025 9 实验操作步骤 9.1 样品处理 无菌操作称取 25 g（mL）样品，置入盛有 225 mL GVC 增菌液的无菌均质袋中 （鲜银耳样品取 1 g， 用剪刀剪碎 ，加入盛有 20 mL GVC 增菌液的无菌均质袋中 ） ，用拍击式均质器拍打 1 min~ 2 min；或置入 盛有 225 mL GVC 增菌液的无菌均质杯中 ，以8 000 r/min~ 10 000 r/min均质 1 min~ 2 min；若样品为液 态，振荡混匀 。 9.2 增菌 将上述样品增菌液置 36 ℃± 1 ℃培养 20 h~24 h。 9.3 分离 用直径 3 mm的接种环取增菌液一环 ，分别划线接种于 mPDA平板和 PCFA平板，36 ℃± 1 ℃培养 24 h~48 h。观察各个平板上生长的菌落 ，各个平板上菌落特征见表 2。 表2　唐菖蒲伯克霍尔德氏菌 （椰毒假单胞菌酵米面亚种 ）在不同分离平板上的菌落特征 培养基 mPDA平板 PCFA平板菌落特征 培养 24 h后，菌落 1 mm~ 2 mm，紫色，光滑，湿润、边缘整齐 ；培养 48 h后，部分菌落中心可有呈草帽状凸起 培养 24 h后，菌落 0.5 mm~ 1 mm，灰白色，光滑，湿润、边缘整齐 9.4 细菌模板 DNA的提取 9.4.1 菌落 DNA提取 自选择性琼脂平板上分别挑取 5个以上典型或可疑菌落 （低于 5个全选） ，将可疑菌落刮取一环重悬 于1 mL生理盐水的无菌离心管中 ，旋涡混匀 ，8 000g离心 5 min，吸弃上清液 ：加入 50 μL DNA提取液 （使用前室温解冻并充分混匀 ，快速吸取 ），混匀后沸水浴 5 min，12 000g离心 5 min，取上清液保存于 -20 ℃备用。 9.4.2 增菌液中 DNA提取 取增菌液 1 mL，加到 1.5 mL无菌离心管中 ，8 000g离心 5 min，吸弃上清液 ：加入 50 μL