中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 出口食品中 β型溶血性链球菌检测方法 实时荧光 PCR法 Method for the detection of β-hemolytic streptococcus in food for export — Real‑time PCR methodICS 07.100.30 CCS X 04 2025 ‑07‑25发布 2026 ‑02‑01实施 中华人民共和国海关总署 　发 布 SN/T 5887—2025SN/T 5887—2025 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第 1部分：标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 。 本文件起草单位 ：拱北海关技术中心 、广东产品质量监督检验研究院 、珠海粤港食品安全检测有限公 司、大连海关技术中心 。 本文件主要起草人 ：姚丽锋、王小玉、张娟、黎财慧、杨爱馥、游淑珠、冯家望、张晴阳、唐食明、曾俊洁、 李清岚。 ⅠSN/T 5887—2025 出口食品中 β型溶血性链球菌检测方法 实时荧光 PCR法 1 范围 本文件描述了出口食品中 β型溶血性链球菌 （Streptococcus ）的实时荧光 PCR检测方法 。 本文件适用于食品中 β型溶血的化脓链球菌 （Streptococcus pyogenes ）和无乳链球菌 （Streptococcus agalactiae ）的快速检测 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件 。不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于 本文件。 GB 4789 .11　食品安全国家标准　食品微生物学检验　 β型溶血性链球菌检验 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489　实验室　生物安全通用要求 GB/T 27403　实验室质量控制规范　食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 3.1 实时荧光 PCR real‑time PCR 在PCR扩增时加入带有荧光基团的特异性探针 （Taqman探针）或荧光染料 ，荧光信号的增加可反 映PCR产物量的增加 ，实现 PCR产物的实时监测 。 3.2 Ct值 cycle threshold value 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 BHQ 1：黑洞淬灭基团 （black hole quencher 1） cfb：成孔蛋白 CAMP毒力因子 （CAMP factor pore‑forming toxin ） DNA：脱氧核糖核酸 （deoxyribonucleic acid ） dATP：脱氧腺苷三磷酸 （deoxyadenosine triphosphate ） dCTP：脱氧胞苷三磷酸 （deoxycytidine triphosphate ） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸 （deoxyguanosine triphosphate ） dNTP：脱氧核苷酸三磷酸 （deoxyribonucleoside triphosphate ） 1SN/T 5887—2025 dTTP：脱氧胸苷三磷酸 （deoxythymidine triphosphate ） FAM：6‑羧基荧光素 （6‑carboxy fluorescein ） PCR：聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction ） spy1258：化脓链球菌 1258基因（Streptococcus pyogenes 1258） Taq：水生栖热菌 （Thermos aquaticus ） Tris：三（羟甲基）氨基甲烷 [tris（hydroxy methyl ）aminomethane ] 5 方法原理 根据 β型溶血的化脓链球菌和无乳链球菌各自特有的靶基因序列 ，化脓链球菌选用其转录调节基因 spy1258基因，无乳链球菌选用编码溶血素基因的 cfb基因，设计特异性的 PCR引物和荧光标记探针 ，提 取模板 DNA进行实时荧光 PCR检测，从而对食品中 β型溶血的化脓链球菌和无乳链球菌进行快速 检测。 6 主要设备及耗材 6.1 实时荧光 PCR仪。 6.2 离心机（≥12 000 r/min） 。 6.3 不同量程微量移液器 ：0.5 μL~10 μL、10 μL~100 μL、20 μL~200 μL、100 μL~1 000 μL。 6.4 恒温培养箱 ：36 ℃± 1 ℃。 6.5 高压灭菌器 。 6.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 （测定波长 280 nm和260 nm） 。 6.7 天平：感量 0.01 g。 6.8 均质器。 6.9 涡旋振荡仪 。 6.10 生物安全柜 。 6.11 离心管：2 mL、1.5 mL和0.2 mL。 6.12 PCR反应管。 6.13 不同量程移液器的配套吸头 。 7 材料与试剂 除另有规定外 ，试剂为分析纯或生化试剂 。试验用水应符合 GB/T 6682中一级水的规格 。所有试 剂均用无 DNA酶污染的容器分装 。 7.1 改良胰蛋白胨大豆肉汤 （modified tryptone soybean broth ，mTSB） ：成分和配制方法见 GB 4789 .11。 7.2 哥伦比亚 CNA血琼脂平板 ：成分和配制方法见 GB 4789 .11。 7.3 Taq DNA聚合酶。 7.4 dNTP：dATP、dTTP、dCTP、dGTP。 7.5 细菌 DNA提取试剂盒 。 7.6 10倍PCR缓冲液：200 mmol/L Tris‑HCl （pH 8.4） ，200 mmol/L KCl ，15 mmol/L MgCl 2。 7.7 引物和探针 引物和探针序列见表 1，其中探针的 5’端标记 FAM，3’端标记 BHQ 1。spy1258基因、cfb基因扩增 2SN/T 5887—2025 的靶标序列参见附录 A。 表1　引物和探针序列 引物 /探针 spy1258 cfb 　　注： 探针的荧光标记物能根据基因扩增仪功能的不同进行调整 。序列（5’→3’ ） F：ATAGAGAATTTATAACCGCACTCGCTAC R：ACTGGCAAGGTAAACTTCTAAAGCAT P：CCGCAACTCATCAAGGATTTCTGTTACCAA F:GTTAATGAGGCTATTACTAGTGTT R:GGCTTCTACACGACTACCA P:CATAAACTGTCTCAGGGTTGGCβ型溶血性链球菌 streptococcus pyogenes （化脓链球菌 ） streptococcus agalactiae （无乳链球菌 ）GenBank no . CP043530 .1 MK134700 .1 8 检验程序 β型溶血性链球菌检验程序见图 1。 K K 3 K  *89 *89 %/"E=1$3  25 gUmL U+ 225 mL mTSB 8" %/"E=1$3 

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E=-@ 图1　β型溶血性链球菌检验程序 3SN/T 5887—2025 9 检测步骤 9.1 样品处理及增菌 、分离 按照 GB 4789 .11的方法进行样品制备和增菌 、分离。 9.2 细菌模板 DNA的制备 9.2.1 增菌液模板 DNA的制备 吸取 1 mL增菌液加入 1.5 mL无菌离心管中 ，12 000 r/min离心 2 min，吸弃上清液 ；采用试剂盒中 的细菌悬浮液重悬细菌 ，并按照细菌 DNA提取试剂盒说明书制备模板 DNA。 9.2.2 可疑菌落模板 DNA的制备 对于分离到的可疑菌落或菌体 ，可直接挑取可疑单菌落于 100 μL无菌生理盐水混匀 ，12 000 r/min 离心 2 min，吸弃上清液 ；采用试剂盒中的细菌悬浮液重悬细菌 ，并按照细菌 DNA提取试剂盒说明书制 备模板 DNA。 9.3 DNA浓度和纯度的测定 取适量 DNA溶液原液加超纯水稀释一定倍数后 ，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定 260 nm 和280 nm处的吸收值 ，DNA的浓度按照式 （1）计算。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ρ=A260×N×50 …………………………… （ 1 ） 式中： ρ——DNA浓度，单位为微克每毫升 （µg/mL） ； A260——260 nm处的吸光值 ； N——核酸稀释倍数 。 当DNA浓度在 10 µg/mL~ 100 µg/mL ，A260/A280在1.7~1.9之间时，适宜于实时荧光 PCR 检测。 9.4 实时荧光 PCR扩增 9.4.1 反应体系 按表 2配制实时荧光 PCR的最终反应体系 。 表2　实时荧光 PCR反应体系 10×荧光定量 PCR反应混合液 上游引物 (10 µmol/L ) 下游引物 (10 µmol/L ) 探针 (10 µmol/L ) dNTP（10 mmol/L ） Taq DNA聚合酶 (5 U/μL)1 0.4 µmol/L 0.4 µmol/L